高血壓是最常見的慢性心血管疾病，與人類多種臟器并發(fā)癥緊密聯(lián)系，嚴(yán)重危害人類的健康。目前，臨床降血壓藥物血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）抑制劑如卡托普利、阿拉普利、依那普利和賴諾普利等雖然藥效明顯，但會(huì)引起嘔吐、心悸等副作用。近年來，食物源生物活性肽因其營養(yǎng)、安全性引起了極大的關(guān)注。

南瓜籽中含有30%～40%的蛋白質(zhì)，氨基酸組成豐富，是一種較好的植物蛋白資源。目前，關(guān)于南瓜籽蛋白源ACE抑制肽的研究相對(duì)較少，南瓜籽肽可能存在的ACE抑制分子機(jī)制也不夠清楚。因此，江蘇經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院健康學(xué)院的何海艷、楊愛萍等人采用堿性蛋白酶水解南瓜籽蛋白釋放ACE抑制肽，通過膜分離技術(shù)獲得ACE抑制肽并通過質(zhì)譜技術(shù)鑒定其結(jié)構(gòu)，同時(shí)利用ACE抑制活性實(shí)驗(yàn)、自發(fā)性高血壓大鼠（SHRs）模型、抑制動(dòng)力學(xué)和分子對(duì)接方法研究ACE抑制肽的降血壓活性和酶抑制機(jī)制，以期為南瓜籽降血壓肽的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1、南瓜籽蛋白的水解及水解物膜分離組分的活性分析

如圖1A所示，南瓜籽蛋白的水解度與水解時(shí)間呈正相關(guān)，水解開始1 h內(nèi)水解度增加較快，水解度達(dá)到7.99%；60～200 min內(nèi)水解度增加了2.99%，水解反應(yīng)速率明顯變慢，4 h后水解度達(dá)到11.23%，南瓜籽蛋白在堿性蛋白酶的作用下充分釋放了其中的活性肽。

由圖1B可知，1 mg/mL質(zhì)量濃度下，PPH ACE抑制活性也因水解物分子質(zhì)量的不同而有所差別。PPH和低于1 kDa肽組分的ACE抑制活性較高，二者ACE抑制活性沒有顯著性差異（P＞0.05），分別為46.81%和46.22%；除3～5 kDa組分外，ACE抑制活性隨著PPH分子質(zhì)量的增大而逐漸降低，5～10 kDa組分ACE抑制活性最低，抑制率為33.74%。

PPH的降血壓活性如圖1C所示，SHRs灌胃PPH（100 mg/kg mb）后，PPH及低于1 kDa PPH組分在灌胃4 h時(shí)表現(xiàn)出了相似的降血壓效果，均降低SHRs收縮壓約14.80 mm Hg，而低于1 kDa PPH組分在灌胃6 h時(shí)表現(xiàn)出了的降血壓效果，降低SHRs的收縮壓約21.42 mm Hg，低于1 kDa PPH組分的降血壓活性優(yōu)于PPH；低于1 kDa PPH組分雖然表現(xiàn)出持續(xù)的降血壓效果，但是仍差于降血壓藥物卡托普利。

2、南瓜籽蛋白肽結(jié)構(gòu)鑒定

為了確定可能引起活性的肽段結(jié)構(gòu)，采用HPLC/Q-TOF-MS/MS鑒定了低于1 kDa PPH組分中南瓜籽蛋白肽組成。在獲得低于1 kDa PPH組分的總離子流色譜圖和一級(jí)質(zhì)譜圖（圖2）的基礎(chǔ)上，利用PEAKS Studio軟件分析并比對(duì)UniProt數(shù)據(jù)庫，從低于1 kDa PPH組分中鑒定出了9 種多肽，分別是Leu-Leu-Val（LLV）、Leu-Val-Phe（LVF）、Leu-Thr-Pro-Leu（LTPL）、Ser-Val-Leu-Phe（SVLF）、Leu-Leu-Pro-Gln（LLPQ）、Met-Leu-Pro-Leu（MLPL）、Leu-Leu-Pro-Gly-Phe（LLPGF）、Val-Leu-Leu-Pro-Glu（VLLPE）、Arg-Phe-Pro-Leu-Leu（RFPLL）。此外，通過嘗試檢索生物活性肽數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)所鑒定的9 種南瓜籽肽均未出現(xiàn)在這些ACE抑制肽或者降血壓肽數(shù)據(jù)中，僅發(fā)現(xiàn)了類似的降血壓肽序列，如LLY、LVY、LVE、LLP、LLF等（檢索數(shù)據(jù)庫：http://bis.zju.edu.cn/biopepdbr/index.php、http://pepbank.mgh.harvard.edu、http://www.nipgr.ac.in/PlantPepDB/），說明本研究從PPH發(fā)現(xiàn)了新的ACE抑制肽。

3、南瓜籽肽的ACE抑制活性及降血壓活性

如圖3A所示，9 種多肽RFPLL、VLLPE、LLPGF、MLPL、LLPQ、SVLF、LTPL、LVF、LLV的ACE半抑制濃度（IC50）分別為0.94、16.57、0.48、0.36、5.32、7.11、5.07、0.17、3.16 mmol/L，其中LLPGF、MLPL、LVF和RFPLL的IC50均低于1 mmol/L，具有較高的ACE抑制活性。

進(jìn)一步評(píng)價(jià)了ACE抑制活性較好的南瓜籽肽LLPGF、MLPL、LVF和RFPLL的降血壓活性（圖3B、C）?？傮w看來，RFPLL具有較好的降血壓活性，灌胃SHRs 6 h后使其收縮壓降低37.0 mm Hg、舒張壓降低17.0 mm Hg；其次是LVF，灌胃SHRs 6 h后使其收縮壓降低22.2 mm Hg、舒張壓降低11.2 mm Hg；而LLPGF和MLPL的降血壓活性相對(duì)較差；RFPLL和LVF灌胃SHRs 24 h后仍然具有一定的降血壓活性，并且在測試的劑量下RFPLL與卡托普利降血壓效果較為接近，說明從南瓜籽蛋白中獲得了效果較好的降血壓肽。

4、南瓜籽肽抑制ACE的動(dòng)力學(xué)分析

由圖4可知，RFPLL是ACE混合型抑制劑，低濃度下（0.5 mmol/L）RFPLL對(duì)ACE是競爭性抑制，較高濃度（1 mmol/L）表現(xiàn)出了非競爭抑制作用；MLPL的雙倒數(shù)直線近似相交于y軸，說明其對(duì)ACE的抑制模式可能是競爭性抑制，而LLPGF、LVF可能是非競爭性抑制類型。

5、南瓜籽肽與ACE的分子對(duì)接

結(jié)果可知，RFPLL、LLPGF、MLPL和LVF均能夠較好地對(duì)接于ACE的活性中心殘基，其中，RFPLL與ACE的殘基Tyr523、Glu162、Asp377之間形成3個(gè)氫鍵，并通過O31、O28螯合Zn2+，獲得了較低的靜電勢(shì)能－231.64 kJ/mol，說明RFPLL能夠通過結(jié)合ACE活性位點(diǎn)S1、S1’及三聯(lián)體催化部位發(fā)揮抑制活性；小分子肽LVF與ACE的5個(gè)殘基His353、Ala354、Tyr520、Lys511、Gln281之間形成9個(gè)氫鍵，并且O2與Zn2+的距離僅有2.78 ?。

結(jié)論

結(jié)果表明：

1）低于1 kDa PPH組分具有較高降血壓活性，灌胃6 h后可以降低SHRs的收縮壓約21.42 mm Hg；2）南瓜籽肽RFPLL、LLPGF、MLPL和LVF具有較好的ACE抑制活性，IC50均低于1 mmol/L，其中RFPLL和LVF具有較好的降血壓活性，灌胃6 h后分別使SHRs的收縮壓降低37.0 mm Hg和22.2 mm Hg、使SHRs的舒張壓降低約17.0 mm Hg和11.2 mm Hg；3）RFPLL、LLPGF、MLPL和LVF可以很好地對(duì)接ACE的活性中心，RFPLL是ACE混合型抑制劑，MLPL對(duì)ACE是抑制模式可能是競爭性抑制，LLPGF、LVF可能是ACE的非競爭性抑制劑。綜上，低于1 kDa PPH是一種良好的降血壓功能食品原料，而RFPLL和LVF可用于降血壓功能食品或者藥品的開發(fā)原料。

本文《南瓜籽蛋白源血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的制備及其降血壓活性》來源于《食品科學(xué)》2021年42卷23期214-220頁，作者：何海艷，劉夢(mèng)婷，楊愛萍，蔣彩云，崔逸，汪洪濤。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20201118-197。