背景^[1-3]

LIMK1抗體是一種可以特異性結(jié)合CCT2的人工合成抗體，可以靶向結(jié)合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的CCT2蛋白。LIMK-1單克隆抗體適用于Western印跡(WB)、免疫沉淀(IP)、免疫熒光(IF)、石蠟包埋切片免疫組化(IHCP)、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。LIMK-1或LIM結(jié)構(gòu)域激酶1是肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)的重要調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、增殖和存活中發(fā)揮著重要作用。通過(guò)磷酸化cofilin，LIMK-1可調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白絲的周轉(zhuǎn)，這對(duì)包括遷移和形態(tài)在內(nèi)的各種細(xì)胞功能至關(guān)重要。包括癌癥和神經(jīng)退行性疾病在內(nèi)的多種疾病都與LIMK-1的失調(diào)有關(guān)，因此LIMK-1成為治療研究的一個(gè)重要靶點(diǎn)。

LIMK1抗體

CCT2抗體使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細(xì)胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預(yù)制膠，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過(guò)37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個(gè)孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，電泳至藍(lán)色染料到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開硅膠，即可打開玻璃板；取膠時(shí)。

3.轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說(shuō)明書，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽(yáng)極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒(méi)在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長(zhǎng)，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復(fù)一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時(shí)。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測(cè)

1）將膜和一抗（CCT2抗體按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過(guò)夜并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(CCT2抗體)。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時(shí)并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時(shí)，按照ECL超敏試劑盒說(shuō)明書，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準(zhǔn)備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應(yīng)用^[4][5]

LIMK1抗體可以用于阿福豆苷通過(guò)抑制LIMK1活性發(fā)揮對(duì)前列腺癌LNCaP、PC-3細(xì)胞增殖和凋亡的影響

觀察Afzelin的體外抗前列腺癌活性及其對(duì)前列腺癌相關(guān)激酶的影響。

方法(1)細(xì)胞培養(yǎng)：雄激素依賴性LNCaP細(xì)胞和雄激素非依賴性PC-3細(xì)胞系從美國(guó)菌種保藏中心(弗吉尼亞州,馬納薩斯)獲得。并據(jù)其建議將LNCaP細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清,谷氨酰胺,2%青霉素-鏈霉素和0.2%慶大霉素的EMEM培養(yǎng)基中。PC-3細(xì)胞生長(zhǎng)于含2 mM左旋谷酰胺、1.5 g/L碳酸氫鈉(90%)+10%胎牛血清的Ham's F12K培養(yǎng)基中。細(xì)胞在37℃含95%空氣和5%二氧化碳濕潤(rùn)環(huán)境中培養(yǎng)。

(2)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LNCaP和PC-3細(xì)胞,接種于96孔培養(yǎng)板(5000個(gè)/孔),每孔100 u1。恒溫箱培養(yǎng)24 h,使細(xì)胞貼壁。次日分別加入不同終濃度(0.1,1,10 ug/ml)的阿福豆苷。每組設(shè)4個(gè)平行孔。在CO2培養(yǎng)箱中再孵育,干預(yù)24 h,48 h,72 h后終止培養(yǎng),0 ug/ml組僅加等量培養(yǎng)液。加入10 ul·WST-1標(biāo)記溶液(WST-1細(xì)胞增殖試驗(yàn)試劑盒；羅氏診斷,印第安納波利斯)后再放置培養(yǎng)箱中孵育2 h。根據(jù)廠家提供的說(shuō)明書,用96孔板酶標(biāo)比色計(jì)檢測(cè)各孔420 nm處的吸光度值(17)。

(3)細(xì)胞周期分析：將培養(yǎng)的LNCaP和PC-3前列腺癌細(xì)胞分別加入不同的濃度的阿福豆苷孵育24 h。粘附細(xì)胞用胰蛋白酶消化并與懸浮細(xì)胞群混合,然后離心,零度PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)洗滌3次,將一部分被洗滌的細(xì)胞染成臺(tái)盼藍(lán)以檢測(cè)細(xì)胞活性。調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1x106細(xì)胞/ml,以2：1的比例(v/v)在冷甲醇固定過(guò)夜,碘化丙啶染色。使用Becton Dickinson(San Jose,CA)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布,分析各個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下的細(xì)胞數(shù)不少于10,000個(gè)。使用CellQuest細(xì)胞周期分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

(4)蛋白印跡分析：檢測(cè)不同濃度(0.1,1及10μg/ml)阿福豆苷對(duì)前列腺癌LNCaP和PC-3細(xì)胞中MRCKα,LIMK1及ROCK1激酶表達(dá)的影響。采用改良Lowry分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度(DC Protein Assay;Bioroad,Hercules,CA)。分解產(chǎn)物在7～10%的變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳。我們將分解后蛋白轉(zhuǎn)輸至硝化纖維,用5%脫脂牛奶或3%BSA(牛血清白蛋白)封口,以1xPBS緩沖至0.1%到20%之間。MRCKα,LIMK1抗體及ROCK1的單克隆抗體在Cell Signaling Technology(Beverly,MA)處購(gòu)買,此抗體已經(jīng)由制造商按照Western blotting的需求進(jìn)行了適度稀釋。

參考文獻(xiàn)

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