背景^[1-3]

NAB2抗體是一種可以特異性結(jié)合NAB2的人工合成抗體，可以靶向結(jié)合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的NAB2蛋白。NAB2抗體與多種技術(shù)兼容，包括免疫印跡(WB)、免疫沉淀(IP)、免疫熒光(IF)、石蠟包埋切片免疫組化(IHCP)、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。NAB2(1C4)抗體有非結(jié)合型和多種結(jié)合型，包括瓊脂糖、辣根過氧化物酶(HRP)、藻紅蛋白(PE)、異硫氰酸熒光素(FITC)和多種Alexa Fluor?結(jié)合物。NAB2蛋白在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用，主要作為轉(zhuǎn)錄因子Egr-1/NGFI-A的共抑制劑發(fā)揮作用。這種相互作用維持了基因表達(dá)的平衡，因?yàn)镹AB2有助于調(diào)節(jié)NGFI-A的活性，而NGFI-A參與細(xì)胞分裂、分化、凋亡等重要的細(xì)胞過程。NAB2主要定位于細(xì)胞核，在那里發(fā)揮調(diào)節(jié)功能，由位于12q13.3-14.1的基因編碼，該區(qū)域在各種實(shí)體瘤、脂肪瘤和脂肪肉瘤中經(jīng)常發(fā)生改變。NAB2在這些區(qū)域的存在凸顯了其在癌癥生物學(xué)中的潛在重要性，使抗NAB2抗體（1C4）成為研究人員研究腫瘤發(fā)生和細(xì)胞調(diào)節(jié)的分子機(jī)制的寶貴工具。

NAB2抗體

NAB2抗體使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細(xì)胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預(yù)制膠，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個(gè)孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，電泳至藍(lán)色染料到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開硅膠，即可打開玻璃板；取膠時(shí)。

3.轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說明書，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復(fù)一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時(shí)。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測

1）將膜和一抗（NAB2抗體按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過夜并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(NAB2抗體)。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時(shí)并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時(shí)，按照ECL超敏試劑盒說明書，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準(zhǔn)備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應(yīng)用^[4][5]

NAB2抗體可以用于探討Egr-1、Nab2和cav-1的表達(dá)與瘢痕增生的相關(guān)性研究

研究早期生長反應(yīng)因子(early growth response gene-1,Egr-1)、NGFI-A結(jié)合蛋白2(NGFI-A binding protein 2,Nab2)及窖蛋白-1(caveolin-1,cav-1)的表達(dá),并探討其與瘢痕組織增生的關(guān)系。

方法:收集于手術(shù)時(shí)切除的正常皮膚組織9例、扁平瘢痕組織8例及增生性瘢痕組織9例,經(jīng)常規(guī)固定、包埋及連續(xù)切片后,應(yīng)用NAB2抗體免疫組織化學(xué)SP法,對9例正常皮膚組織、8例扁平瘢痕和9例增生性瘢痕進(jìn)行Egr-1、Nab2和cav-1蛋白表達(dá)的檢測。

NAB2抗體結(jié)果:Egr-1在增生性瘢痕表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于正常皮膚和扁平瘢痕組織,Egr-1在正常皮膚組織、扁平瘢痕及增生性瘢痕組織中的表達(dá)呈逐漸升高趨勢;而Nab2和cav-1在正常皮膚組織、扁平瘢痕及增生性瘢痕組織中的表達(dá)顯示與Egr-1不同的分布模式,即Egr-1表達(dá)逐漸升高,而Nab2和cav-1表達(dá)則逐漸降低。結(jié)論:Egr-1、Nab2和cav-1的表達(dá)改變與瘢痕增生密切相關(guān),Egr-1表達(dá)上調(diào),Nab2和cav-1表達(dá)缺失可能是瘢痕增生進(jìn)展的指標(biāo)。

參考文獻(xiàn)

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