背景^[1-3]

CDK5R1抗體是一種可以特異性結(jié)合CCT2的人工合成抗體，可以靶向結(jié)合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的CCT2蛋白。CDK5RAP1單克隆抗體可用于免疫印跡(WB)、免疫沉淀(IP)、免疫熒光(IF)、石蠟包埋切片免疫組化(IHCP)、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。CDK5RAP1，即細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶5調(diào)節(jié)亞基相關(guān)蛋白1，在調(diào)節(jié)神經(jīng)元發(fā)育和功能方面起著至關(guān)重要的作用。CDK5RAP1參與調(diào)控CDK5的活性，而CDK5的活性對(duì)正常的神經(jīng)元信號(hào)傳導(dǎo)和突觸功能至關(guān)重要。研究表明，CDK5RAP1在不同組織類(lèi)型和發(fā)育階段的表達(dá)水平各不相同。CDK5RAP1的失調(diào)與多種神經(jīng)退行性疾病有關(guān)，這凸顯了它在維持神經(jīng)元健康方面的重要性。

CDK5R1抗體

CDK5R1抗體使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細(xì)胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預(yù)制膠，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿(mǎn)tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過(guò)37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個(gè)孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開(kāi)電源，電泳至藍(lán)色染料到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開(kāi)硅膠，即可打開(kāi)玻璃板；取膠時(shí)。

3.轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說(shuō)明書(shū)，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽(yáng)極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒(méi)在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長(zhǎng)，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復(fù)一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時(shí)。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測(cè)

1）將膜和一抗（CCT2抗體按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過(guò)夜并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(CCT2抗體)。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時(shí)并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時(shí)，按照ECL超敏試劑盒說(shuō)明書(shū)，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準(zhǔn)備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應(yīng)用^[4][5]

CDK5R1抗體可以用于養(yǎng)血清腦藥物拮抗AD動(dòng)物模型Tau磷酸化信號(hào)的變化和機(jī)制研究

研究了YXQN藥物拮抗AD的細(xì)胞和動(dòng)物模型中Tau信號(hào)的變化及其機(jī)制。首先在動(dòng)物水平上,利用正常小鼠(WT)、AD疾病小鼠(APP/PS1)和YXQN藥物治療AD小鼠(APP/PS1+YXQN)比較和分析了各組小鼠鼠腦組織海馬區(qū)Tau信號(hào)相關(guān)基因的表達(dá)變化。

選取了正常、疾病以及代表AD中度病程的8月齡給藥2月至10月齡的YXQN藥物治療小鼠,利用表達(dá)譜芯片分析,通過(guò)正常-疾病-養(yǎng)血治療三組小鼠的兩兩比較,篩選到2390個(gè)差異基因;并對(duì)其中與AD信號(hào)通路相關(guān)的13個(gè)基因,在alzdata數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行了CFG分析,評(píng)分結(jié)果顯示Cdk5r1(磷酸激酶CDK5激活蛋白p35)和Mapt(Tau)基因與AD關(guān)聯(lián)最為密切。同時(shí)發(fā)現(xiàn),Mapt(Tau)在AD疾病中減少,在YXQN藥物治療后恢復(fù),提示YXQN藥物治療后恢復(fù)Tau蛋白(促微管活性)的表達(dá)。同時(shí)發(fā)現(xiàn),與正常組比較,AD疾病組動(dòng)物腦內(nèi)的磷酸酶(Ppp1r16b,Ppp2r4)表達(dá)下調(diào),磷酸激酶(Cdk5r1)表達(dá)顯著上調(diào);在YXQN藥物治療下,磷酸酯酶(Ppp1r16b,Ppp2r4)表達(dá)恢復(fù),磷酸激酶(Cdk5r1)表達(dá)水平降低。進(jìn)而,通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證了Ppp2r4(PP2A),Cdk5r1(p35)和Mapt(Tau)3種神經(jīng)纖維纏結(jié)相關(guān)差異表達(dá)基因的變化趨勢(shì)。Tau蛋白過(guò)度磷酸化導(dǎo)致的神經(jīng)纖維纏結(jié),是AD的核心病變之一。為了驗(yàn)證基因芯片發(fā)現(xiàn)的兩種Tau信號(hào)基因參與YXQN藥物的AD治療,通過(guò)CDK5R1抗體免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了兩種基因在各組小鼠腦組織中的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與正常組相比,AD小鼠大腦組織的磷酸激酶(Cdk5r1)表達(dá)水平升高,隨著YXQN藥物濃度增加,Cdk5r1(p35)在海馬DG區(qū),CA3區(qū)和皮層處染色程度下降。而Tau蛋白本身在YXQN藥物治療后,染色程度隨YXQN藥物濃度逐漸增加。所以,篩選并發(fā)現(xiàn)兩種Tau信號(hào)基因,MAPT(Tau)和Cdk5r1(p35/p25;一種重要的Tau磷酸化激酶激活蛋白),參與AD病變和YXQN藥物拮抗AD的病理過(guò)程。異常的過(guò)度磷酸化(例如5～9個(gè)磷酸基)致使Tau蛋白喪失功能,導(dǎo)致神經(jīng)纖維纏結(jié)。

參考文獻(xiàn)

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