背景[1-3]
DEAE-DEXTRAN細胞轉染試劑盒適用于瞬時轉染(transient tranfection)，不宜用于篩選穩(wěn)定表達細胞株，這是因為DEAE-dextran在較高濃度作用較長時間會對細胞產(chǎn)生一定毒性。氯喹的加入可以抑制溶酶體對外源DNA的降解，從而提高轉染效率。但對于具體的細胞、具體的培養(yǎng)條件，如需獲得更加理想的轉染效率，須自行摸索上述各種轉染方法，找出優(yōu)化的轉染方法。CHO、DUKX、BⅡ等細胞也可以通過甘油、DMSO進行熱休克處理以提高轉染效率。
外源基因導入真核細胞的方法有很多種，如磷酸鈣轉染法、DEAE-葡聚糖(Dextran)轉染法、脂質體法、電穿孔法、顯微注射法等。DEAE-葡聚糖轉染法的原理是帶正電荷的DEAE-葡聚糖不帶負電的核酸的磷酸骨架相互作用，形成復合物，該復合物通過細胞內吞噬作用使DNA轉導進入細胞核。
DEAE-DEXTRAN細胞轉染試劑盒
操作步驟：
1.在轉染前24h用胰蛋白酶消化培養(yǎng)細胞，取適量對數(shù)期細胞轉移至新的培養(yǎng)器皿中，待細胞密度達50～70%即可進行轉染。后續(xù)操作步驟均按6孔板計算，如果轉染器皿不同，請按比例自行調節(jié)用量。
2.棄培養(yǎng)液，用PBS清洗細胞2次，再用TBS-D buffer清洗1次，吸盡殘液。
3.配制轉染液:對于6孔板，按照下表依次加入8μl DEAE-Dextran，2μl DNA以及適量的TBS-D，使其總體積為170μl，即為DEAE-Dextran-DNA-TBS-D轉染液，用移液器輕輕吹打混勻，但不宜采用離心或Vortex等劇烈方式。
4.轉染：把170μl轉染液滴加到細胞表面，輕輕晃動6孔板，使其不細胞表面充分接觸，37℃孵育20～40min，觀察細胞至皺縮變圓為止。
5.緩慢加入1.7ml細胞培養(yǎng)液(約DEAE-Dextran-DNA-TBS-D轉染液體積的10倍)。
6.加入17μl Chloroquine solution，亦可和上一步驟中1.7ml細胞培養(yǎng)液預先混合后一起加入。
7.培養(yǎng)不超過2h或在出現(xiàn)明顯的細胞毒性前，更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，通常轉染后48～72小時可以檢測轉染效果。
應用[4][5]
用于DJ-1基因慢病毒的構建及耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞轉染研究
蒙古沙鼠圓窗膜上滴注不同濃度的哇巴因,建立不同程度耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞（Spiral Ganglion Cells,SGCs）損傷的動物模型;通過該動物模型鼓階內注入DJ-1基因慢病毒,研究耳蝸SGCs受損后,DJ-1基因慢病毒的轉染及其保護作用。方法：①聽力正常的雄性蒙古沙鼠隨機分成實驗組與對照組。對照組沙鼠的右耳圓窗膜上滴注人工外淋巴液0.2ml,實驗組沙鼠分成A、B、C三組并在右耳圓窗膜分別滴注濃度為33μM、66μM、80μM總量為0.2ml的哇巴因建立動物模型。
②包裝DJ-1基因慢病毒。
③聽力正常的蒙古沙鼠隨機分為實驗組及對照組,對照組沙鼠右耳圓窗膜上滴注人工外淋巴液0.2ml,并于鼓階注入DJ-1基因慢病毒;實驗組沙鼠分成A、B、C三組并于右耳圓窗膜分別滴注濃度為33μM、66μM、80μM總量為0.2ml的哇巴因,每組鼓階注入DJ-1慢病毒。兩周后行Western Blot實驗檢測DJ-1蛋白質的表達。在蛋白質確切表達的基礎上觀察DJ-1對于不同程度耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞損傷的修復作用。
結果：形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn):隨著哇巴因濃度的上升,SGCs數(shù)量逐漸下降及細胞腫脹,胞漿空泡化,胞核固縮或溶解。Western Blot實驗檢測到在正常及不同程度SGCs損傷的動物模型中,DJ-1基因慢病毒均有轉染,并表達相關蛋白;本實驗中不同程度SGCs損傷的動物模型中注射DJ-1慢病毒,較對照組SGCs無增加。
結論：①圓窗膜滴注不同濃度哇巴因可以成功建立不同程度SGCs損傷的動物模型。
②通過293T細胞可以成功包裝DJ-1基因慢病毒。
③以慢病毒為載體包裝的DJ-1基因可以成功轉染SGCs,并表達相應蛋白。
④本實驗中不同程度SGCs損傷的動物模型中DJ-1蛋白無神經(jīng)保護作用。
參考文獻
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[3]Audiological Profile of Adult Persons with Auditory Neuropathy Spectrum Disorders.[J].Yuvaraj Pradeep,Jayaram Mannarukrishnaiah.Journal of audiology＆otology.2016(3)
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[5]方浩.DJ-1基因慢病毒的構建及耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞轉染研究[D].昆明醫(yī)科大學,2019.