背景[1-3]
禽白血病病毒(ALV)通用核酸試劑盒(熒光-PCR法)適用于檢測的全血、帶有白血細(xì)胞的血漿或血清、脾臟、肝臟、腎臟等標(biāo)本中禽白血病病毒，適用于禽白血病病毒感染的輔助診斷。
禽白血病病毒（Avian Leukosis Virus,ALV）是引發(fā)禽類發(fā)生腫瘤性疾病的一種重要病原，同時能導(dǎo)致感染機(jī)體發(fā)生嚴(yán)重的細(xì)胞和體液免疫抑制以及生長抑制，進(jìn)而易與其它病原如馬立克病病毒（MDV）、傳染性法氏囊病病毒（IBDV）等并發(fā)或混合感染。目前，還沒有有效的疫苗和藥物用于ALV防治，主要通過不斷檢測并淘汰陽性雞來不斷凈化雞群。熒光PCR技術(shù)因靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作方便成為禽白血病病原檢測的重要手段。本試劑盒可以檢測包括A亞型、B亞型、C亞型、D亞型、E亞型以及K亞型和J亞型在內(nèi)的多種禽白血病分型。
禽白血病病毒(ALV)通用核酸試劑盒(熒光-PCR法)
禽白血病病毒(ALV)通用核酸試劑盒(熒光-PCR法)檢測原理與性能
1.檢測原理
禽白血病病毒(ALV)通用核酸試劑盒(熒光-PCR法)基于熒光定量PCR技術(shù)，針對ALV保守序列設(shè)計特異性引物和探針，通過RT-PCR擴(kuò)增病毒RNA，結(jié)合熒光信號變化實現(xiàn)定量檢測
2.性能指標(biāo)
靈敏度：最低可檢測至10-100拷貝/mL，適用于低病毒載量樣本
特異性：雙重特異性設(shè)計（引物+探針），避免與其他禽類病毒交叉反應(yīng)
精密度：批內(nèi)變異系數(shù)（CV）≤5%，確保結(jié)果可重復(fù)性
抗干擾能力：在甘油三酯（≤300mg/dL）、膽紅素（≤10mg/dL）等干擾物質(zhì)存在下，結(jié)果偏差≤±10%
禽白血病病毒(ALV)通用核酸試劑盒(熒光-PCR法)樣本處理與核酸提取
1.樣本類型
鼻咽拭子、血清、血漿、組織勻漿液、細(xì)胞培養(yǎng)液等均可適用。
2.處理步驟
血清/血漿：低溫離心（3000rpm，10-30分鐘）后分裝，-20℃保存，避免反復(fù)凍融。
組織勻漿：加入生理鹽水研磨后離心取上清，推薦使用核酸提取試劑盒（如離心柱法）提高提取效率。
核酸提取液：部分試劑盒支持快速提?。?3分鐘完成），無需酚抽提，安全性高。
禽白血病病毒(ALV)通用核酸試劑盒(熒光-PCR法)實驗操作流程
1.試劑準(zhǔn)備
預(yù)混反應(yīng)液（含引物、探針、酶）分裝至PCR管，加入模板RNA/DNA
2.PCR擴(kuò)增參數(shù)
程序設(shè)置：
預(yù)變性：93℃3-5分鐘
擴(kuò)增循環(huán)：93℃40s→58℃30s→72℃60s（30-35次循環(huán)）
終延伸：72℃7分鐘
熒光通道：FAM檢測通道，無淬滅染料（部分試劑盒需手動設(shè)置）
3.結(jié)果分析
Ct值判定：Ct≤35為陽性，35標(biāo)準(zhǔn)曲線：通過已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品建立，計算病毒載量
禽白血病病毒(ALV)通用核酸試劑盒(熒光-PCR法)產(chǎn)品特點與注意事項
1.核心優(yōu)勢
快速檢測：全程3小時內(nèi)完成，適用于高通量篩查
防污染設(shè)計：含UNG酶或dUTP系統(tǒng)，降低氣溶膠污染風(fēng)險
2.注意事項
實驗分區(qū)操作（試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)、擴(kuò)增區(qū)），避免交叉污染
陽性質(zhì)控品需與待測樣本同步處理，確保擴(kuò)增體系有效性
試劑保存條件：-20℃避光，避免反復(fù)凍融
應(yīng)用[4][5]
禽白血病病毒(ALV)通用核酸試劑盒(熒光-PCR法)可以用于不同檢測方法在禽白血病凈化檢測中的應(yīng)用與比較
禽白血病是一種由禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）感染引起的免疫抑制性疾病,主要以垂直傳播為主,可以誘發(fā)多器官發(fā)生腫瘤,嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展。ALV主要分為A-K共11種不同亞群,其中ALV-A、ALV-B、ALV-J、ALV-K四個亞群是目前我國主要流行的代表亞群。禽白血病一旦發(fā)生,將會對養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失,被列為我國種禽場必須要實現(xiàn)凈化的主要禽病之一。禽白血病p27抗原檢測是病毒凈化的關(guān)鍵檢測靶標(biāo),選擇靈敏度高、操作簡便的p27抗原檢測方法或試劑盒對于實施凈化至關(guān)重要。
本研究建立了可用于評價試劑盒靈敏度的樣品盤,并利用其比較了磁微?；瘜W(xué)發(fā)光、ELISA、膠體金免疫層析技術(shù)以及禽白血病病毒(ALV)通用核酸試劑盒(熒光-PCR法)等用于雛雞檢測的可行性。1.不同方法用于四種亞群ALV胎糞樣品中p27抗原的直接檢測將A、B、J、K四個亞群ALV經(jīng)卵黃囊接種SPF雞胚,構(gòu)建雛雞感染模型,出殼后逐只采集1日齡雛雞胎糞,分別用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光檢測試劑盒、A/B/C 3家公司ELISA試劑盒、膠體金檢測試紙條和熒光定量PCR等4種方法進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示,磁微?；瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)靈敏性高,可以將所有陽性樣品檢出,3家公司ELISA試劑盒中,A公司敏感性最好,B、C兩公司略差。總體上,各檢測技術(shù)檢出結(jié)果基本一致,膠體金試紙條有一定誤差,除個別弱陽性樣品膠體金和B、C兩家試劑盒檢測不出,如B-01樣品,但是能夠滿足日常監(jiān)測需求。
2.不同方法用于不同稀釋度的四種亞群ALV胎糞樣品p27抗原檢測分別抽取四個亞群樣品盤中兩個陽性胎糞樣品,每個樣品分別按照2-5、2-6、2-7、2-8、2-9依次做五個稀釋度,比較不同試劑盒的檢測結(jié)果。結(jié)果顯示,對ALV-J陽性胎糞樣品,除膠體金檢測試紙條外其他方法幾乎都可以檢測到2-9梯度,當(dāng)稀釋至2-8梯度時,磁微?；瘜W(xué)發(fā)光檢測試劑盒和A、B兩家公司ELISA試劑盒可以檢測出A、B、K三個亞群樣品的陽性,而膠體金大概只能檢測到稀釋至2-7梯度時樣品的陽性,且僅能通過顯色度深淺進(jìn)行陽性程度的判定。各檢測方法均可檢出稀釋至2-6時的陽性樣品,讀值有所差異。通過上述對比可以看出,磁微?；瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)檢測靈敏度最高,不同公司ELISA試劑盒靈敏度差異性較大,膠體金檢測試紙條靈敏度相對上述檢測技術(shù)靈敏度稍低。
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