背景[1-3]
犬瘟熱病毒(CDV)ELISA試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測樣本中的犬瘟熱病毒(CDV)。
檢測原理：往預先包被犬瘟熱病毒（CDV）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的。顏色的深淺和樣品中的犬瘟熱病毒（CDV）呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
犬瘟熱病毒(CDV)ELISA試劑盒
犬瘟熱病毒(CDV)ELISA試劑盒實驗所需自備試驗器材：
1.酶標儀（450nm）
2.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3.37℃恒溫箱4.蒸餾水或去離子水
犬瘟熱病毒(CDV)ELISA試劑盒樣本處理及要求：
1.血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜，然后1000×g離心20分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復凍融。2.血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復凍融。3.組織勻漿：用預冷的PBS(0.01M,pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調(diào)整，并做記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。4.細胞培養(yǎng)物上清：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復凍融。5.其它生物標本：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測。6.樣品外觀：樣品應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。7.樣品保存：樣品收集后若在1周內(nèi)進行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個月內(nèi)檢測），或-80℃（6個月內(nèi)檢測），避免反復凍融，標本溶血會影響后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
犬瘟熱病毒(CDV)ELISA試劑盒操作步驟：
1.取出所需板條。
2.設(shè)置標準品孔和樣本孔；
3.樣本孔先加待測樣本；空白孔不加。
4.除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5.棄去液體，加洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液,如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。
6.每孔加入底物A、B各，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入終止液，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。
犬瘟熱病毒(CDV)ELISA試劑盒結(jié)果判斷繪制標準曲線：在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應(yīng)OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。
犬瘟熱病毒(CDV)ELISA試劑盒試劑盒性能
1.準確性：標準品線性回歸與預期濃度相關(guān)系數(shù)R值，大于等于0.9900。
2.靈敏度：最低檢測濃度小于（參考說明書）
3.特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。
4.重復性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%。
5.貯藏：2-8℃，避光防潮保存。
6.有效期：6個月。
應(yīng)用[4][5]
犬瘟熱病毒(CDV)ELISA試劑盒可以用于犬瘟熱病毒F蛋白原核表達及其單克隆抗體制備
研究通過對CDV野毒LN(10)1株F基因序列進行分析,采用PCR方法克隆F蛋白胞外區(qū)基因,并與原核表達載體p ET-28a連接構(gòu)建了p ET-28a-CDV-F重組質(zhì)粒。經(jīng)測序鑒定后將其轉(zhuǎn)化至Escherichia coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞,并使用優(yōu)化后的條件對重組菌進行IPTG誘導,超聲破碎后,經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和免疫印跡(Western blot)對其表達形式及其特異性進行鑒定。
實驗結(jié)果顯示,重組F蛋白在37℃、IPTG濃度為0.2 mmol/L,誘導6 h后表達量最高,主要以包涵體表達,蛋白大小約為33 k Da。利用KCl染色切膠純化法成功純化F重組蛋白,蛋白濃度為1.66 mg/m L。經(jīng)Western blot鑒定后,重組F蛋白可以分別與抗His標簽單克隆抗體和CDV陽性血清反應(yīng),具有良好的反應(yīng)原性。為獲得抗CDV F蛋白的單克隆抗體,將純化后的重組F蛋白與弗氏佐劑等量乳化,以此為免疫原對BALB/c小鼠腹腔注射免疫。經(jīng)3次常規(guī)免疫和1次加強免疫后取小鼠脾細胞與SP2/0細胞進行細胞融合,利用有限稀釋法與犬瘟熱病毒(CDV)ELISA試劑盒篩選陽性雜交瘤細胞,并將篩選出穩(wěn)定分泌抗體的細胞株注射至小鼠腹腔制備腹水。最終獲得2株單克隆抗體,命名為1B6和1G8。采用抗體亞類試劑盒對篩選出的2株單克隆抗體進行亞類鑒定,結(jié)果表明2株單克隆抗體均屬于Ig M,κ型。以原核表達出的CDV F重組蛋白為包被抗原建立的間接ELISA法測得1B6、1G8上清效價分別為1:1 600和1:3 200,腹水效價均達到10～6。
參考文獻
[1]First complete genome sequence of Asia-4 lineage of canine distemper virus in China.[J].Bi Zhenwei.Virus genes,2022(1)
[2]C Protein is Essential for Canine Distemper Virus Virulence and Pathogenicity in Ferrets.[J].Siering Oliver;Sawatsky Bevan;Pfaller Christian K.Journal of virology.2020
[3]Development of a double monoclonal antibody-based sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for detecting canine distemper virus.[J].Zhang Yuan;Xu Gang;Zhang Lu;Zhao Jiakai;Ji Pinpin;Li Yaning;Liu Baoyuan;Zhang Jingfei;Zhao Qin;Sun Yani;Zhou EnMin.Applied microbiology and biotechnology.2020
[4]Viral Pathogenesis,Recombinant Vaccines,and Oncolytic Virotherapy:Applications of the Canine Distemper Virus Reverse Genetics System[J].Jianjun Zhao;;Yanrong Ren;;Jie Chen;;Jiasan Zheng;;Dongbo Sun.Viruses.2020
[5]隋萍.犬瘟熱病毒F蛋白原核表達及其單克隆抗體制備[D].黑龍江八一農(nóng)墾大學,2023.