背景^[1-3]

口蹄疫病毒A型(FMDV-A)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光-PCR法)適用于檢測(cè)口蹄疫病毒A型(FMDV-A)的RNA，用于口蹄疫病毒A型(FMDV-A)感染的輔助診斷，其檢測(cè)結(jié)果僅供參考。產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，僅提供人工合成的特異性RNA片段標(biāo)準(zhǔn)品作為陽(yáng)性對(duì)照，僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療用途。

A型塞內(nèi)卡病毒（Senecavirus A,SVV）是一種豬新發(fā)病毒,主要在育肥豬和母豬引發(fā)嚴(yán)重的水皰性疾病,新生仔豬死亡率高達(dá)100%,主要癥狀表現(xiàn)為厭食、嗜睡、發(fā)熱以及皮膚和鼻鏡部位的水皰病變。同屬于微小RNA病毒科的豬捷申病毒（Porcine Teschovirus,PTV）和口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）同樣是豬新發(fā)和再發(fā)傳染病的主要病原體。這三種病毒性疾病難以通過(guò)臨床表現(xiàn)進(jìn)行區(qū)分。因此,準(zhǔn)確和快速的診斷對(duì)實(shí)施有效的防控策略至關(guān)重要。

蹄疫病毒A型(FMDV-A)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光-PCR法)

檢驗(yàn)原理

口蹄疫病毒A型(FMDV-A)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光-PCR法)針對(duì)口蹄疫病毒A型的高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針，在反應(yīng)體系中含口蹄疫病毒A型基因組模板的情況下，PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號(hào)。利用熒光定量PCR儀對(duì)PCR過(guò)程中相應(yīng)通道信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和輸出，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的定性分析。

產(chǎn)品特點(diǎn)

特異性好：采用TaqMan熒光探針?lè)ㄟM(jìn)行擴(kuò)增。

靈敏度高：檢測(cè)靈敏度可達(dá)500copies/uL以下。

操作簡(jiǎn)便：采用一步法熒光定量RT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增，逆轉(zhuǎn)錄步驟與PCR擴(kuò)增在一管反應(yīng)液中完成。

適用儀器

ABI、安捷倫、Roche、博日，天隆，宏石，鯤鵬等熒光定量PCR儀。

自備：無(wú)DNA/RNA酶的1.5mL離心管，0.2mL PCR反應(yīng)管，濾芯吸頭(規(guī)格:10μL，200μL，1000μL)，離心機(jī)，振蕩混合器，各種規(guī)格的移液器。

操作步驟

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1.樣本前處理

1.2.DNA提取

2.試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

3.加樣（樣本處理區(qū)）

4.PCR擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

5.結(jié)果分析判定

6.質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：無(wú)明顯擴(kuò)增曲線或無(wú)Ct值顯示；陽(yáng)性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長(zhǎng)期，且Ct值≤30；以上條件應(yīng)同時(shí)滿足，否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。7.產(chǎn)品性能指標(biāo)陰陽(yáng)性參考品符合率：5份陽(yáng)性參考品符合率為100％；10份陰性參考品符合率為100％。最低檢測(cè)限：檢測(cè)靈敏度可達(dá)500copies/uL以下。精密度：批內(nèi)、批間精密度檢測(cè)Ct值的變異系數(shù)（CV）均小于等于3%。

應(yīng)用^[4][5]

口蹄疫病毒A型(FMDV-A)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光-PCR法)可以用于A型塞內(nèi)卡病毒核酸檢測(cè)方法的建立及其VP1蛋白單克隆抗體制備

建立了一種能同時(shí)檢測(cè)SVV、FMDV和PTV的三重Taqman熒光定量PCR方法,并且制備了針對(duì)SVV VP1蛋白的單克隆抗體,為臨床上SVV的防控提供了重要支撐。1.SVV、FMDV及PTV慢病毒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建為了更好模擬病毒本身特點(diǎn),確保熒光定量PCR技術(shù)在病毒定量檢測(cè)中的準(zhǔn)確性,采用基于慢病毒體系構(gòu)建的熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品能有效提高檢測(cè)的可靠性。

本研究利用“三質(zhì)粒包裝”系統(tǒng),構(gòu)建了包含SVV VP1、FMDV VP1和PTV 5’UTR基因保守序列的復(fù)制缺陷型慢病毒顆粒,利用嘌呤霉素最小致死量對(duì)所包裝的完整慢病毒顆粒進(jìn)行滴度測(cè)定,所測(cè)得SVV、FMDV和PTV慢病毒滴度分別為:2×10～7 TU/m L、2×10～8 TU/m L和2×10～6 TU/m L。2.SVV、FMDV及PTV三重Taqman熒光定量檢測(cè)方法的建立為實(shí)現(xiàn)SVV、FMDV和PTV三種病原核酸的同時(shí)檢測(cè),本研究針對(duì)SVV VP1、FMDV VP1和PTV 5’UTR保守區(qū)域設(shè)計(jì)了引物和探針,通過(guò)擴(kuò)增體系優(yōu)化、特異性、靈敏性、重復(fù)性等試驗(yàn),以重組陽(yáng)性質(zhì)粒和慢病毒cDNA為標(biāo)準(zhǔn)品分別建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線。重組陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品所建標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為:SVV:Y=-3.521×X+12.31,R2=0.997;FMDV:Y=-3.399×X+13.75,R2=0.998;PTV:Y=-3.264×X+14.75,R2=0.997。慢病毒標(biāo)準(zhǔn)品所建標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為:SVV:Y=-3.144×X+20.05,R2=0.996;FMDV:Y=-3.536×X+16.30,R2=0.995;PTV:Y=-3.133×X+18.56,R2=0.991。標(biāo)準(zhǔn)曲線表明重組陽(yáng)性質(zhì)粒拷貝數(shù)和各病毒粒子數(shù)與其Ct值之間呈良好線性關(guān)系。對(duì)比商品化的口蹄疫病毒A型(FMDV-A)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光-PCR法)等試劑盒本方法特異性檢測(cè)驗(yàn)證該方法能夠特異地檢測(cè)SVV、FMDV和PTV三種病毒,對(duì)豬流行性腹瀉病毒、豬圓病毒環(huán)2型、豬流感病毒、經(jīng)典豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒、豬德?tīng)査跔畈《?、博卡病毒、諾如病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬胸膜肺炎放線桿菌、豬多殺性巴氏桿菌及格拉瑟氏菌等多種病原均無(wú)交叉反應(yīng)。靈敏度試驗(yàn)結(jié)果表明SVV、FMDV和PTV的最低檢測(cè)濃度均可達(dá)到1×10～1/μL;重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明組間和組內(nèi)變異系數(shù)均小于5%。利用構(gòu)建好的三重TaqMan熒光定量PCR開(kāi)展臨床樣本檢測(cè),對(duì)浙江省內(nèi)部分地區(qū)送檢仔豬或死亡仔豬的肛拭子、肺臟、脾臟等共126份樣品進(jìn)行檢測(cè),均未檢測(cè)出三種病毒。

參考文獻(xiàn)

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