背景^[1-3]

犬細(xì)小病毒(CPV)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光-PCR法)適用于檢測(cè)犬細(xì)小病毒(CPV)的DNA，用于犬細(xì)小病毒(CPV)感染的輔助診斷，其檢測(cè)結(jié)果僅供參考。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，僅提供人工合成的特異性DNA片段標(biāo)準(zhǔn)品作為陽(yáng)性對(duì)照，僅限于專(zhuān)業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療用途。

犬細(xì)小病毒（Canine Parvovirus,CPV）可引起犬的劇烈嘔吐、出血性腸炎、脫水、白細(xì)胞減少和心肌炎等癥狀。臨床上犬細(xì)小病毒病可分為腸炎型和心肌炎型，對(duì)犬造成很大危害。CPV有3種亞型，主要是在VP2蛋白上有基因差異，即CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c。感染CPV的犬主要通過(guò)糞便向外排毒，因此糞便是犬間傳遞感染的主要傳染源。CPV常規(guī)檢測(cè)方法主要有病毒分離鑒定、血凝和血凝抑制試驗(yàn)、ELISA和PCR等方法。PCR法靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單，已被廣泛用于CPV診斷。

犬細(xì)小病毒(CPV)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光-PCR法)

技術(shù)原理

犬細(xì)小病毒(CPV)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光-PCR法)采用TaqMan一步法熒光定量PCR技術(shù)，結(jié)合特異性擴(kuò)增引物對(duì)目的基因進(jìn)行體外擴(kuò)增，本試劑盒具有靈敏性高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，操作簡(jiǎn)便，污染概率低等特點(diǎn)。

Real Time PCR(qPCR)，即實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)，是一種利用熒光染劑檢測(cè)每次PCR循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法技術(shù)，是常規(guī)PCR的衍生反應(yīng)。主要是通過(guò)熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過(guò)ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的關(guān)系對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析。因其具有靈敏、特異、精確以及使用簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已發(fā)展成為分子生物學(xué)研究中的重要工具。

產(chǎn)品特點(diǎn)

特異性好：采用TaqMan熒光探針?lè)ㄟM(jìn)行擴(kuò)增。

靈敏度高：檢測(cè)靈敏度可達(dá)500copies/uL以下。

操作簡(jiǎn)便：采用一步法熒光定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增，逆轉(zhuǎn)錄步驟與PCR擴(kuò)增在一管反應(yīng)液中完成。

適用儀器

ABI、安捷倫、Roche、博日，朗基，柏恒等梯度PCR儀。

自備：無(wú)DNA/RNA酶的1.5mL離心管，0.2mL PCR反應(yīng)管，濾芯吸頭(規(guī)格:10μL，200μL，1000μL)，離心機(jī)，振蕩混合器，各種規(guī)格的移液器。

操作步驟

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

1.2DNA提取

2.試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

3.加樣（樣本處理區(qū)）

4.PCR擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

5.結(jié)果分析判定；

應(yīng)用^[4][5]

犬細(xì)小病毒(CPV)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光-PCR法)可以用于犬細(xì)小、犬瘟熱和犬冠狀病毒三重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法的建立和應(yīng)用

犬瘟熱病毒（Canine distemper Virus,CDV）、犬冠狀病毒（Canine coronavirus,CCoV）和犬細(xì)小病毒（Canine parvovirus,CPV）是犬最為常見(jiàn)的傳染病,均具有較強(qiáng)的傳染性和較高的致死率,無(wú)明顯的季節(jié)影響,一年四季均可感染。并且在臨床中三種病毒間易發(fā)生混合感染,嚴(yán)重危害了犬類(lèi)健康。熒光定量PCR技術(shù)具備高靈敏度與強(qiáng)特異性,多重PCR檢測(cè)方法可以同時(shí)檢測(cè)多種病毒,節(jié)省時(shí)間和成本。

研究構(gòu)建了一種能夠同時(shí)檢測(cè)這三種病原的多重?zé)晒舛縋CR方法,具體研究?jī)?nèi)容如下:（一）CPV、CDV和CCoV三重PCR檢測(cè)方法的建立本研究根據(jù)CPV的VP2基因序列、CDV的N基因序列和CCoV的ORF1b基因序列保守區(qū)來(lái)設(shè)計(jì)引物,將各病原的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別與T載體連接,成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品p MD19-T-CPV、p MD19-T-CDV和p MD19-T-CCoV。通過(guò)犬細(xì)小病毒(CPV)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光-PCR法)對(duì)引物、探針和退火溫度的優(yōu)化成功構(gòu)建了CPV、CDV和CCoV三重PCR檢測(cè)方法。特異性檢測(cè)結(jié)果顯示,這三對(duì)引物僅針對(duì)特定病原產(chǎn)生反應(yīng),與其他病原不存在任何交叉反應(yīng)。CPV、CDV和CCoV的敏感性分別為2.69×10～2copies/μL、2.78×10～2copies/μL和2.57×10～2copies/μL。該方法具有良好的特異性和敏感性,適用于臨床病料的檢測(cè)。（二）CPV、CDV和CCoV三重TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立同樣在三種病原的基因序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針,以上述構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板,經(jīng)過(guò)犬細(xì)小病毒(CPV)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光-PCR法)優(yōu)化成功建立了用于CPV、CDV和CCoV的三重TaqMan熒光定量PCR方法,并對(duì)該方法的特異性、敏感性以及重復(fù)性這三個(gè)關(guān)鍵性指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。特異性檢測(cè)結(jié)果顯示這三對(duì)引物僅針對(duì)特定病原產(chǎn)生反應(yīng),與其他病原不存在任何交叉反應(yīng)。敏感性結(jié)果顯示CPV、CDV和CCoV的最低檢測(cè)限分別為2.69copies/μL、2.78 copies/μL和2.57 copies/μL。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的R2值均高于0.99,表明該方法具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。重復(fù)性結(jié)果顯示CPV、CDV和CCoV組內(nèi)CV值均小于2.7%,組間CV值均小于4.1%。通過(guò)對(duì)68份臨床樣本檢測(cè)發(fā)現(xiàn),相較于膠體金試紙卡與傳統(tǒng)PCR技術(shù),本研究建立的三重TaqMan熒光定量PCR法對(duì)CPV、CDV和CCoV三種病原的檢測(cè)具有更高的準(zhǔn)確性和敏感性。

參考文獻(xiàn)

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