背景[1-3]
人肺癌標志物DR-70(DR-70TM)Elisa試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）。在預(yù)包被抗人肺癌標志物DR-70（DR-70TM）抗體（固相抗體）的微孔酶標板中，加入人肺癌標志物DR-70（DR-70TM）校準品和待測樣本，再加入另一株HRP標記的抗人肺癌標志物DR-70（DR-70TM）抗體（酶標抗體），經(jīng)過溫育與充分洗滌，去除未結(jié)合的組分，在微孔板固相表面形成固相抗體-抗原-酶標抗體的夾心復(fù)合物。加底物A和B，底物在HRP催化下，產(chǎn)生藍色產(chǎn)物，在終止液（2M硫酸）作用下，最終轉(zhuǎn)化為黃色，在酶標儀450nm波長上測定吸光度（OD值），吸光度（OD值）與待測樣品中人肺癌標志物DR-70（DR-70TM）的濃度正相關(guān)。擬合校準品曲線，可以計算出樣本中人肺癌標志物DR-70（DR-70TM）的濃度。
人肺癌標志物DR-70(DR-70TM)Elisa試劑盒
人肺癌標志物DR-70(DR-70TM)Elisa試劑盒樣本處理及要求：
1.血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。
2.血漿：應(yīng)根據(jù)標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。
3.尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
4.細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
5.組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。
6.標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
7.不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
人肺癌標志物DR-70(DR-70TM)Elisa試劑盒操作程序：
所有試劑和組分都先恢復(fù)到室溫，標準品、質(zhì)控品和樣品，建議做復(fù)孔。
1、按前面說明書描述的方法，配制好試劑盒各種組分的工作液。
2、從鋁箔袋中取出所需板條，剩余的板條用自封袋密封放回冰箱。
3、設(shè)置標準品孔、0值孔、空白孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL，0值孔加樣本稀釋液50μL，空白孔不加，樣本孔加待測樣本50μL。
4、除空白孔外，標準品孔、0值孔和樣本孔，加入辣根過氧化物酶（HRP）標
記的檢測抗體100μL。
5、用封板膜蓋住反應(yīng)板，37℃水浴鍋或恒溫箱避光孵育60min。
6、揭開封板膜，棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置20S，甩
去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)5次。若使用自動洗板機，請按洗板機操
作程序進行洗板，添加浸泡30s的程序，可以提高檢測的精度。洗板結(jié)束，加
底物前，要在干凈不掉屑的紙上，充分拍干反應(yīng)板。
7、將底物A和B按1:1體積充分混合，所有孔中加入底物混合液100μL。用
封板膜蓋住反應(yīng)板，37℃水浴鍋或恒溫箱避光孵育15min。
8、所有孔加入終止液50μL，在酶標儀450nm波長上讀取各孔吸光度（OD值）。
應(yīng)用[4][5]
人肺癌標志物DR-70(DR-70TM)Elisa試劑盒可以用于影像學(xué)與檢測血清腫瘤標志物診斷早期肺癌的實驗研究
探討經(jīng)氣管插管由同軸微導(dǎo)管超選擇精確定位,灌注不同劑量的甲基膽蒽(methylcholanthrene,MCA)、二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine,DEN)及超液化碘油混懸液,誘導(dǎo)犬肺癌模型,為肺癌深入研究建立新的平臺。通過影像學(xué)的胸部X線平片、計算機螺旋斷層掃描攝像術(shù)(spiral computed tomography,螺旋CT)、數(shù)字減影血管造影(digital substraction angiography,DSA)檢查、血.清腫瘤標志物(tumor maker,TM)檢測及病理檢查,探討肺癌發(fā)生發(fā)展過程中早期的影像學(xué)表現(xiàn),血清腫瘤標志物的改變及病理學(xué)表現(xiàn),從分子生物影像學(xué)提出早期肺癌診斷的新標準,使肺癌綜合治療的臨床效果產(chǎn)生一個新飛躍。
材料與方法選用30只犬齡1-3歲,體重15-20Kg的雜種犬為研究對象,雌雄均有。實驗前均行疫苗接種,觀察數(shù)日確定犬仍處于健康狀態(tài)后隨機將30只犬分為A(8只)、B(8只)、C(7只)、D(7只)四組。飼養(yǎng)數(shù)日觀察實驗犬正常,經(jīng)犬前腿取靜脈血3m1,室溫下保存0.5-1h,離心取上層血清,進行腫瘤標志物的檢測。將犬進行全身麻醉,采用改良式氣管插管出同軸微導(dǎo)管精確定位向右肺隔葉灌注致癌藥物：A、C組灌注甲基膽葸(MCA)0.25g+二乙基亞硝胺(DEN)0.38g+超液化碘油混懸3m1；B、D組灌注甲基膽葸(MCA)0.35g+二乙基亞硝胺(DEN)0.48g+超液化碘油混懸3m1。分別在第6、12個月對四組實驗犬再次進行血清TM檢測。同時分別行X線胸片、CT、DSA檢查。C、D組實驗犬在飼養(yǎng)12月做完上述檢查后處死,取注藥部位肺組織,加10%中性福爾馬林液固定,石蠟包埋(切片厚度5μm)HE染色,根據(jù)標本染色情況,選取結(jié)構(gòu)完整標本進行后續(xù)染色觀察及統(tǒng)計處理。使用包括人肺癌標志物DR-70(DR-70TM)Elisa試劑盒等檢測四組實驗犬不同時期CA125、Cyfra21-1、CEA、SCC-Ag、Cal 53、DR70、NSE 7種血清TM,對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理,觀察TM指標是否隨時間的推移增高。
參考文獻
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[5]聶春暉.影像學(xué)與檢測血清腫瘤標志物診斷早期肺癌的實驗研究[D].天津醫(yī)科大學(xué),2011.