臺(tái)盼藍(lán)(Trypan Blue)是組織和細(xì)胞培養(yǎng)中最常用的死細(xì)胞鑒定染色方法之一。正常的活細(xì)胞，胞膜結(jié)構(gòu)完整，能夠排斥臺(tái)盼藍(lán)，細(xì)胞不被染色；而死細(xì)胞的胞膜不完整，通透性增加，可使臺(tái)盼藍(lán)滲入將細(xì)胞染成藍(lán)色。因此，借助臺(tái)盼藍(lán)染色可以簡(jiǎn)單、快速地區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。

臺(tái)盼藍(lán)染色法的局限性，以及當(dāng)前最受認(rèn)可的AO/PI熒光染核法的原理和優(yōu)越性。

臺(tái)盼藍(lán)濃度

用臺(tái)盼藍(lán)染細(xì)胞時(shí)應(yīng)該用什么濃度？回答五花八門：有將0.4% （4 g/100 ml)）臺(tái)盼藍(lán)溶液和細(xì)胞1：1混合的（稀釋2倍），有1：9混合的（稀釋10倍），還有把臺(tái)盼藍(lán)原液當(dāng)稀釋液，想加多少就加多少的……

目前臺(tái)盼藍(lán)染細(xì)胞的濃度并沒(méi)有可參照的標(biāo)準(zhǔn)，各實(shí)驗(yàn)室都是根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書或習(xí)慣自行制定?？墒遣煌瑵舛鹊呐_(tái)盼藍(lán)會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不同的染色效果嗎？

Nexcelom的科學(xué)家們將同一Jurkat細(xì)胞樣本與0.4%，0.2%，0.1%，0.05%和0.025%的臺(tái)盼藍(lán)以1：1比例混合，以下是部分濃度染色后的細(xì)胞圖片：

從圖中我們可以發(fā)現(xiàn)，0.4%和0.1%臺(tái)盼藍(lán)（終濃度分別為0.2%和0.05%）染上的細(xì)胞比0.025%（終濃度為0.0125%）臺(tái)盼藍(lán)更多，即檢測(cè)出更多死細(xì)胞。此外，0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色的樣本中“氣球”狀形態(tài)的細(xì)胞明顯比其他濃度更多。下面的直方圖統(tǒng)計(jì)了不同濃度臺(tái)盼藍(lán)下的死細(xì)胞（較深著色）和“氣球”狀細(xì)胞的濃度。

由此可見(jiàn)，不同濃度的臺(tái)盼藍(lán)會(huì)產(chǎn)生不同的細(xì)胞染色效果。高濃度的臺(tái)盼藍(lán)更容易使死細(xì)胞破裂產(chǎn)生“氣球”，而當(dāng)“氣球”顏色特別淺的時(shí)候容易被漏數(shù)。低濃度的臺(tái)盼藍(lán)不會(huì)產(chǎn)生“氣球”狀細(xì)胞，但過(guò)低的濃度可能不足以染上所有死細(xì)胞，使得檢測(cè)不夠靈敏。這兩種情況都會(huì)導(dǎo)致死細(xì)胞被低估，即存活率被高估。Nexcelom公司建議所有Cellometer用戶使用0.2%的臺(tái)盼藍(lán)和細(xì)胞樣本1：1混合后（終濃度0.1%）上機(jī)檢測(cè)。

為了進(jìn)一步研究不同濃度臺(tái)盼藍(lán)對(duì)細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生的影響，研究者分別用明場(chǎng)光學(xué)顯微鏡和相差顯微鏡對(duì)0.4%和0.1%臺(tái)盼藍(lán)染色的細(xì)胞進(jìn)行拍照。

0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色的光學(xué)顯微鏡圖片中有一個(gè)淺色的“氣球”狀細(xì)胞，然而這個(gè)細(xì)胞在相差顯微鏡下是觀察不到的，說(shuō)明該細(xì)胞不具備折射光的能力，已經(jīng)失去了細(xì)胞結(jié)構(gòu)。0.1%臺(tái)盼藍(lán)染色的光學(xué)顯微鏡圖片中有一個(gè)深色的死細(xì)胞，該細(xì)胞在相差顯微鏡中依然可以被顯示，說(shuō)明其仍具備細(xì)胞結(jié)構(gòu)。這個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了上一節(jié)的“Hold”不住假設(shè)。

臺(tái)盼藍(lán)染色時(shí)間

臺(tái)盼藍(lán)是一種具有毒性的化學(xué)染料，若染色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)除了死細(xì)胞也會(huì)滲入活細(xì)胞，降低細(xì)胞的存活率。Mascotti等人在2000年發(fā)表的一篇文獻(xiàn)中專門研究了臺(tái)盼藍(lán)和AO/PI對(duì)細(xì)胞的毒性。作者們將HPC細(xì)胞和0.4%臺(tái)盼藍(lán)或AO/PI染料混合后放置在室溫。在此后的2小時(shí)測(cè)量時(shí)間中，前一小時(shí)每隔10分鐘取一次樣計(jì)數(shù)，后一小時(shí)每隔15分鐘取一次樣計(jì)數(shù)。

上圖記錄了每個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩種方法測(cè)得的存活率。AO/PI（實(shí)心點(diǎn)）染色的細(xì)胞在2小時(shí)區(qū)間內(nèi)始終保持很高的存活率（~98%），而臺(tái)盼藍(lán)（空心點(diǎn)）染色的細(xì)胞存活率從96.2%降到了89.8%。由此可見(jiàn)AO/PI對(duì)細(xì)胞的毒性非常小，而臺(tái)盼藍(lán)對(duì)細(xì)胞的毒性在2小時(shí)內(nèi)已經(jīng)十分明顯。所以臺(tái)盼藍(lán)染色后需要盡快完成細(xì)胞計(jì)數(shù)，一般建議不要超過(guò)10分鐘。