背景及概述[1]
柱層析硅膠分為正相柱層析硅膠和反向柱層析硅膠2 種，正相柱層析硅膠填料為正相硅膠，適合分離相對極性較小的化合物，例如各類苷元；所以通常選用極性較小的有機溶劑作為洗脫劑，例如石油醚-二氯甲烷洗脫系統(tǒng)，氯仿-乙酸乙酯洗脫系統(tǒng)等。反向柱層析硅膠使用的是反相硅膠，適合分離極性相對較大的化合物，例如生物堿等各類苷類，常采用甲醇-水，乙腈-水不同比例作為洗脫劑。
柱層析硅膠在上樣時，常分為干法上樣和濕法上樣。干法上樣將待分離物質(zhì)溶解后拌在少量硅膠 G中，待揮發(fā)至干后填入裝好的硅膠柱中，再加層析液進行洗脫。濕法上樣先將硅膠 G 用洗脫液溶脹后裝入硅膠柱，再將溶解好的樣品倒入硅膠柱進行分離。這2 種方法對物質(zhì)分離效果差別不大，濕法上樣操作簡單便捷，但溶解樣品用二氯甲烷、乙酸乙酯等極性較小的溶劑，對于一些溶解度小的物質(zhì)，宜使用干法上樣。
應用舉例[1]
從天然產(chǎn)物中提取、分離和表征生物小分子，是新藥研發(fā)中獲得先導化合物的主要途徑之一。層析法（Chromatography）是天然產(chǎn)物分離最常用的方法之一。 層析法最早是根據(jù)化合物顏色分離一些植物色素，如今，層析法已經(jīng)演變成為一種高度敏感的、有效的化合物分離和鑒定方法。柱層析一般包括常壓柱層析、中壓柱層析和高壓柱層析。按照柱填料又可分為柱層析硅膠、離子交換層析、凝膠滲透色譜、疏水作用色譜等，其中以柱層析硅膠（正/反相）使用最為廣泛。與其他層析方法相比，柱層析具有操作簡單，經(jīng)濟實惠 ，樣品承載量大等優(yōu)點，是天然產(chǎn)物分離純化的首選方法之一。
1拌樣
拌樣是柱層析硅膠干法上樣的一個重要環(huán)節(jié)。拌樣所用的硅膠 G 的量要合適 ，一般以樣品質(zhì)量∶硅膠G質(zhì)量=1∶3 為宜。若硅膠G 過多，則柱層析樣品層過厚，各個組分容易發(fā)生交錯重疊；若硅膠G過少， 則樣品不能完全吸附 在硅膠G中，使樣品損失嚴重。此外，拌樣不均勻也是影響實驗結(jié)果的重要因素。具體方法如下：
1）稱取1g粗提物，按照粗提物質(zhì)量∶硅膠G質(zhì)量=1∶3 稱取3g硅膠G于蒸發(fā)皿中。
2）將樣品用有機試劑完全溶解，在通風廚中吸取少量樣品滴加到硅膠G中，用藥勺將樣品攪拌均勻，待樣品揮發(fā)至干后繼續(xù)滴加樣品，直至將樣品全部拌入硅膠G中。期間不斷用藥勺攪拌硅膠G防止拌樣不均勻。
3）將揮發(fā)干的硅膠G在通風廚中放置過夜，使有機試劑完全揮發(fā)。
2裝柱
裝柱是柱層析硅膠最重要的環(huán)節(jié) ，柱子質(zhì)量直接決定樣品的分離效果和得率。首先，保證柱身豎直，否則洗脫時樣品條帶會呈傾斜，嚴重時洗脫產(chǎn)物不純，需要重新純化。其次，硅膠G要壓實，不能留有氣泡，否則樣品條帶會呈彌散型 ，影響分離效果。具體步驟如下：
1）將玻璃柱豎直架于鐵架臺上。
2）按照質(zhì)量比樣品∶硅膠G=1∶40 稱取硅膠G40g。將硅膠G倒入硅膠柱內(nèi)，拍打柱身使硅膠粉壓實，期間不斷旋轉(zhuǎn)柱體，使硅膠G填充均勻。
3）將拌好樣的硅膠G倒入硅膠柱內(nèi)，同樣拍打柱身并不斷旋轉(zhuǎn)柱體，使樣品層均勻。
4）在樣品層上鋪一層約0.5 cm厚的硅膠G，防止加層析液時樣品層飛濺。
3 樣品接收
配制 3 倍柱體積的層析液，超聲10 min。打開玻璃柱閥門，緩慢將層析液傾倒入硅膠柱內(nèi)至滿。選擇合適大小的試管接收流出液，一般10~20 mL/管為宜，流速1 mL/min，過快樣品拖尾嚴重，過慢則樣品條帶彌散。如果目標產(chǎn)物與雜質(zhì)極性相差不大，可以采用梯度層析系統(tǒng)。梯度層析又稱梯度洗脫，是指用不同極性洗脫劑分別對樣品進行洗脫，達到分離的效果。正相柱層析硅膠如需要梯度層析，則按照層析液極性由小到大依次倒入物質(zhì)硅膠柱內(nèi)。注意層析液極性差別不應過大，且換層析液極性前，盡可能將硅膠上方的層析液流盡。
4 檢測與合并
以 20 mL/管收集流出液，共收集10管，分別對這 10 管 流 出 液 進 行 TLC 檢測，展開劑為二氯甲烷∶乙酸乙酯=9∶1（圖3）。合并1~4 管，5~7管 ，8~10管，旋蒸至干計算樣品質(zhì)量，分別為7 mg，10mg和4 mg。分別轉(zhuǎn)移至EP管中，編號樣品 1、2、3，-20℃保存。合并時如果樣品量足夠，為了保證純度，可以棄去純度不高的接收液；如果樣品量少，不足以進行之后的產(chǎn)物鑒定實驗，要將所有含有目標物質(zhì)的接收液合并，并進一步純化。
主要參考資料
[1]劉延杰,陳彎彎,向碧云,朱旭東,郝曉冉.硅膠柱層析分離天然產(chǎn)物實驗要點分析[J].生物學通報,2018,53(06):44-46.