雷公藤為衛(wèi)矛科雷公藤屬植物雷公藤 Tripterygium wilfordii Hook．f．的干燥根，是一 種公認的同時具有較強藥效和較強毒性的中藥 材．也是一種對難治性疾病具有突出且療效穩(wěn)定 的少有中藥之一，廣泛用于治療類風濕性關節(jié) 炎、腎病綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病。但其 毒性較大，不良反應高發(fā)，嚴重程度通常是患者 不能耐受的，嚴重影響其臨床應用。雷公藤的主 要有效成分為二萜類、三萜類和生物堿類，研究 表明各種成分均具有不同程度的抗炎、抗腫瘤和 免疫抑制等活性，而雷公藤中生物堿毒性要藥效 二萜和三萜類成分，同時臨床應用具有療效好且 不良反應較小的特點。雷公藤次堿是雷公藤生物 堿中含量較高的一種倍半萜類單體化合物。本實 驗主要通過建立脂多糖(I。PS)誘導的 RAW264．7細胞炎癥模型，探討雷公藤次堿對 LPS誘導的炎性因子TNF一0：和IL一6釋放的影 響，以免疫印跡法(Western Blot)考察雷公藤 次堿對連接蛋白TLR4、MyD88、p38、IKBa、 JNK、ERK在I，PS刺激的RAW264．7細胞中的 表達及其磷酸化的影響，以研究其抗炎作用機 制，為促進雷公藤次堿的應用研究提供基礎。
一、材料與儀器
儀器：Model 2300型培養(yǎng)箱(美國Shel— I，ab公司)；Model 680型酶聯(lián)免疫檢測儀(BIO —RAD公司)；溫控搖床(New Brunswich， USA)；電泳儀DYY一6C型(北京市六一儀器 廠)；蛋白質垂直電泳儀(北京百晶生物技術有 限公司)；半干轉電轉槽(北京市六一儀器廠)； 恒溫水槽DKB一501A型(上海精宏設備有限公 司)；X射線攝影暗盒(江蘇海門凱順醫(yī)療器械 有限公司)；凝膠成像系統(tǒng)(上海培清科技有限 公司)；熒光酶標儀(上海閃譜生物科技有限公司)。
試劑：CCK一8試劑盒(規(guī)格：500次／瓶， 上海翊圣生物科技有限公司)；小鼠TNF—a試 劑盒、小鼠IL一6試劑盒(上海西塘生物技術有 限公司，規(guī)格：96T)；脂多糖(LPS，美國Sig— ma公司，批號L一2880)；吐溫一80(國藥集團 化學試劑有限公司，分析純)；胰酶(美國Difco 公司)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco 公司)j TMB底物溶液(上海恒遠生物科技有限公司)；Dihydroethidium(南京恩晶生物科技有 限公司)；DCFH—DA探針(上海Sigma公司)； 蛋白酶／磷酸酶抑制劑混合物(vazyme，E312— 01)；RIPA(動物細胞總蛋白抽提試劑) (碧云 天生物技術研究所，P0013B)；BCA Protein Quantification Kit(vazyme，E112—01)；增強 型ECI?；瘜W發(fā)光檢測試劑盒(即用型) (vazyme，E411)；麗春紅染色試劑(碧云天生物 技術研究所，P0022)；PVDF膜(0．45um) (Millipore，IPVH00010)；預染蛋白Marker (10～11 7KD) (Thermo。26616)；封閉液(脫 脂奶粉，pH7．5) (BD，232100)；抗體稀釋液 (碧云天生物技術研究所，C1230)；PBS—T (pH8．0，10 x) (碧云天生物技術研究所， B1009)；10×電轉移緩沖液(碧云天生物技術研 究所，B1006)；10×電泳緩沖液(碧云天生物技 術研究所，B1005)；SDS—PAGE上樣緩沖液 (還原，5×)(碧云天生物技術研究所，B1007)； 顯影粉定影粉(天津市世紀奧博商貿有限公司)； X膠片(日本柯達)。
二、方法
(一)雷公藤次堿對RAW264．7細胞增殖的 影響 取對數(shù)生長期RAW264．7細胞，胰酶消化， 加入新鮮培養(yǎng)基反復吹打成細胞混懸液，調整細 胞濃度為1×105 cells·mL-1，以每孔100／,I。細 胞懸液接種于96孑L細胞培養(yǎng)板中(空白組加等 量培養(yǎng)基)，置于37。C，5％CO：細胞培養(yǎng)箱中 過夜后取出分組處理。①雷公藤次堿組：每孔加 入lo肚L的樣品溶液，使終濃度分別為175、 145、115、85、55肛m01·L；②對照組和③空 白組：加入等量培養(yǎng)基，每組設6個復孔(n一 6)。置于37℃，5％CO。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，實 驗結束4h前加入10肚L CCK～8試劑，結束后以 酶標儀于450nm處檢測吸光度(A)。
(二)雷公藤次堿對LPS刺激的RAW264．7 細胞分泌TNF—a和II。一6的影響 取對數(shù)生長期RAW264．7細胞，胰酶消化， 加入新鮮培養(yǎng)基反復吹打，使細胞混懸，調整細 胞濃度為l×10j cells·mL_。，以每孔100ltI．接 種于96孔細胞培養(yǎng)板，置于37℃，5％CO。培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后取出分組處理。①雷公藤次堿組：加入終濃度為1”g·mI。_1的LPS溶液于 37℃，5％CO2 培養(yǎng)箱中孵育2h后給予終濃度為 115、57.5、28.8μg·L-1、14．4／1mol·I。_1的雷公藤次堿 溶液；②模型組：加入終濃度為1μg·L-1的 LPS溶液；③對照組和④空白組加入等量培養(yǎng) 基；每組設6個復孔(n一6)。于37℃．5％CO2： 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后取出，吸取細胞上清液，采 用EI。ISA試劑盒分別檢測上清中TNF～a和1L-6含量。
(三)Western Blot檢測雷公藤次堿對 TLR4、MyD88、p—p38、p38、P—JNK、JNK、 p—ERK、ERK和IKBa的影響 取對數(shù)生長期RAW264．7細胞，調整細胞 濃度到2.25×105 cells·mL-1 ，以每孔2mL接 種于6孔板，置于37℃，5％CO：培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 過夜。分為模型組、對照組、雷公藤次堿處理組 (115、57.5、28.8, tool·I。1)，除空白組外其他 組給予終濃度lttg·mI。l LPS刺激2h后給予相 應藥物進行處理。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，用 4℃預冷的PBS液洗滌各孑L兩次，然后吸棄PBS 液，每孔中加入200／,I。4。C預冷的RIPA提取細胞蛋白，在13000 r·min…下離心20min，棄去 上清，得各樣本，Bradford法對蛋白定量。每孑L 加入20t,g蛋白上樣，在SDS--PAGE凝膠中電 泳，蛋白轉移到PVDF膜上，脫脂牛奶或BSA 封閉，分別用一抗TLR4、MyD88、P—p38、 p38、P—JNK、JNK、P—ERK、ERK、IxBa和 B—Actin過夜，洗2．4。
(四)統(tǒng)計分析與灰度分析
統(tǒng)計學方法實驗數(shù)據(jù)用i±S表示，采用單 因素方差檢驗法進行統(tǒng)計學處理。應用Alpha軟 件處理Western Blot實驗所得系統(tǒng)分析目標帶的 光密度值，并以各目的8一actin蛋白條帶灰度值 與目標條帶灰度值的比值作為蛋白相對表達水 平值。 三、結果 由CCK8考察結果可知，雷公藤次堿在濃度 不高于115t,mol·L1時對RAW264．7細胞的增 殖無顯著抑制作用，故選擇考察115、57．5、 28．8、14．4t,mol·I。1的雷公藤次堿對I。PS刺激 的RAW264．7細胞分泌TNF—a和II。一6的影 響，結果見表1。
討論和小結
研究發(fā)現(xiàn)，LPS誘導后RAW264.7細胞 Toll樣受體4(TLR4)的表達明顯增高，說明 LPS是或可引導TI，R4的配體與TLR4結合，二 者結合后可啟動細胞內一系列信號級聯(lián)反應，最 終誘導目的基因的表達。TLRs亞型中除TLR3 外，均需要MyD88(Myeloid Different Factory 88，MyD88)來激活下游釋放信號分子的通路 這種途徑成為MyD88依賴性途徑。當TI。R與相 應配體結合后，TLR細胞內的TIR結構，募集 到與TIR有相同結構域的接頭分子MyD88，然 后MyD88的死亡結構域(Death Domain，DD) 與IL一1受體相關激酶(IL一1 Receptor--aSSOciated Kinase，IRAK)家族蛋白分子結合，形成細胞信號轉導復合物。該復合物可激活下游 TRAF6分子，TRAF6激活絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen—activated protein kinase，MAPK)家 族分子。
NF一-kB是一種多效性的轉錄因子，可被包 括I，PS、氧化應激在內的多種刺激所活化，參與 調控炎癥反應、免疫、腫瘤等相關的細胞因子、 趨化因子、黏附分子、炎癥介質等的轉錄過程。 1KB是其抑制蛋白，正常情況下二者結合而使NF一 出處于失活狀態(tài)，bcBa是1KB的亞分子，它被磷 酸化后NF～kB被釋放而恢復活性，從而進人細 胞核，與DNA上的相應位點結合，調控mRNA 的合成而實現(xiàn)相關基因的表達。
研究結果表明，雷公藤次堿可在RAW264.7 細胞炎癥通路的多水平上產生抑制作用，最終結 果表現(xiàn)為抑制RAW264．7細胞中炎癥因子的釋 放。如：雷公藤次堿可顯著抑制TI。R4和 MyD88的表達，進而抑制其下游的炎癥相關通 路的激活；顯著抑制絲裂原活化蛋白激酶家族分 子P38，JNK，ERK的磷酸化，從而阻斷 TRAF6信號轉導途徑；還可顯著抑制NF—JcB 抑制蛋白IKB oc的磷酸化，從而調控NF一kB的結 合與釋放，最終影響炎癥因子的合成。