在細(xì)胞體外培養(yǎng)中，污染如同潛伏的“隱形殺手”，時(shí)刻威脅著實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性。在最常見的三大污染源——支原體、細(xì)菌和真菌中，支原體污染以 30%-60% 的超高污染率，成為科研人員最頭疼的難題之一。本期細(xì)胞學(xué)堂，我們將全方位解析支原體污染的防治要點(diǎn)，助你輕松應(yīng)對這一實(shí)驗(yàn)室“頑疾”，為細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航。
什么是支原體？
支原體（Mycoplasma），又稱霉形體，屬于柔膜體綱（Mollicutes），是目前已知的最小的原核生物之一。其結(jié)構(gòu)由脂蛋白膜、核糖體和圓形雙鏈DNA組成（圖1），基因組大小為580-2,200 kb。
支原體雖可在無生命培養(yǎng)基上生長，但其生物合成能力有限（如無法自主合成膽固醇等物質(zhì)），必須依賴外源營養(yǎng)成分的補(bǔ)充。細(xì)胞培養(yǎng)體系為其提供了適宜的生長條件，是支原體繁殖的理想環(huán)境。此外，支原體還可以附著于宿主細(xì)胞表面長期繁殖并存活。同時(shí)，由于支原體對多種常見抗生素具有耐藥性，這也為其在細(xì)胞培養(yǎng)過程中滋生并引發(fā)污染埋下隱患。
圖1. 支原體模式圖
支原體污染的表現(xiàn)
自然界中支原體種類超過120種，而細(xì)胞培養(yǎng)中常見污染菌株主要包括牛精氨酸支原體、發(fā)酵支原體、豬鼻支原體、人口腔支原體、牛無膽甾支原體等。這些菌株污染細(xì)胞后，會(huì)引發(fā)細(xì)胞一系列特征性改變，包括：
1、細(xì)胞生長速率異常，增殖減慢或停滯；
2、形態(tài)改變，貼壁細(xì)胞貼壁性變差、易脫落；
3、染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常，核型不穩(wěn)定；
4、細(xì)胞膜抗原性改變，細(xì)胞黏附能力異常；
5、代謝通路紊亂，糖酵解、氨基酸代謝速率變化；
6、細(xì)胞復(fù)蘇后存活率降低。
這些變化缺乏特異性，但會(huì)干擾細(xì)胞正常生理狀態(tài)，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果失真甚至錯(cuò)誤。由于支原體的直徑僅0.1-0.3 μm，遠(yuǎn)小于常規(guī)細(xì)胞，且無細(xì)胞壁，折光性極低，因此難以通過普通光學(xué)顯微鏡識(shí)別。加之其對青霉素等常用抗生素具有耐藥性，進(jìn)一步增加了污染檢測和清除的難度。因此，上述細(xì)胞表型的異常改變往往成為污染的早期預(yù)警信號(hào)—— 當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)不明原因的生長或形態(tài)異常時(shí)，需優(yōu)先排查支原體污染可能。
支原體污染檢測
精準(zhǔn)檢測是防治支原體污染的關(guān)鍵。當(dāng)前常見的支原體檢測方法包括觀察法、培養(yǎng)法、免疫法、DNA熒光染色法、分子法和發(fā)光法（表1）。其中，培養(yǎng)法和DNA熒光染色法是《中國藥典》推薦的支原體污染檢測方法。培養(yǎng)法是檢測支原體的金標(biāo)準(zhǔn)，但操作周期長，而qPCR是靈敏度最高的支原體快速檢測方法。
表1. 支原體檢測方法對比
支原體清除方法
在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)支原體污染后，及時(shí)有效的清除至關(guān)重要。支原體清除的核心是破壞其脂蛋白膜結(jié)構(gòu)、抑制關(guān)鍵代謝途徑（如蛋白質(zhì)或DNA合成）。由于支原體與細(xì)胞在培養(yǎng)特性上相似，如何在清除支原體的同時(shí)保持細(xì)胞的活性是很大的挑戰(zhàn)。
01 熱處理法
支原體的耐受溫度范圍在35-37℃，將污染的細(xì)胞置于41℃處理5-10 h（最長不超過18 h），可以殺滅支原體。但不同的細(xì)胞對高溫的耐受程度不同，此方法可能損傷細(xì)胞，需要慎重使用。
02 抗生素法
支原體對部分抗生素（如卡那霉素、慶大霉素、多西環(huán)素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星等）具有一定的敏感性。將細(xì)胞培養(yǎng)在含抗生素的培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，連續(xù)多次檢測支原體為陰性，即清除成功。但過度使用抗生素可能誘導(dǎo)耐藥或毒性反應(yīng)，需謹(jǐn)慎操作。
03 復(fù)合型支原體清除試劑
推薦使用復(fù)合型支原體清除試劑，其通常含有抗生素和支原體脂蛋白膜穿透劑，能破壞支原體的脂蛋白膜、干擾其代謝途徑、抑制DNA復(fù)制，從而達(dá)到清除支原體的目的。推薦產(chǎn)品：普諾賽Anti-Myc 支原體清除試劑（貨號(hào)：P-CMR-001）。按照說明書將適量試劑加入細(xì)胞培養(yǎng)基孵育，即可清除支原體。該方法操作簡便、效果顯著，且對細(xì)胞的毒性相對較小，能較好地保持細(xì)胞的活性。
對清除支原體后的細(xì)胞，需通過 qPCR、DNA熒光染色等方法進(jìn)行檢測，確認(rèn)支原體是否已被完全清除，避免試劑殘留或支原體復(fù)蘇導(dǎo)致假陰性結(jié)果。
支原體雖小，卻是細(xì)胞培養(yǎng)中破壞性極大的污染源。唯有了解其特性、及時(shí)發(fā)現(xiàn)污染信號(hào)，并掌握合適的檢測與清除手段，才能真正守護(hù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的可靠性與穩(wěn)定性。
以上是關(guān)于支原體污染防治的全攻略。更多細(xì)胞培養(yǎng)干貨，請持續(xù)關(guān)注細(xì)胞學(xué)堂專欄~
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