背景^[1-3]

人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞源自一位28歲男性腺樣囊性癌患者，人腭部小涎腺腺樣囊性癌組織小塊靜置培養(yǎng)7天細(xì)胞開始生長，首次傳代50天，BALB/C,CBA,Swiss，DF裸小鼠皮下移植成瘤，表達(dá)角蛋白。STR檢測發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞被HeLa細(xì)胞污染。

人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞

人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞培養(yǎng)步驟：

人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1）準(zhǔn)備RPMI-1640培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2）人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

三．人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞處理：

1）復(fù)蘇人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入250px皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

對于貼壁人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.收到細(xì)胞后首次傳代推薦將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新的含6ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，建議凍存一支備用，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2到1:5的比例進行。

3）人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進行細(xì)胞凍存。

下面T25瓶為例；

1，人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù)。

2，4min1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細(xì)胞密度不低于1x10E6/ml，每支凍存管凍存1ml細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。

3，將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個小時以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4][5]

人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞可以用于茉莉酸甲酯對人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞生長抑制作用及其機制的實驗研究

以腺樣囊性癌ACC-2細(xì)胞為研究對象,通過體外實驗研究,從細(xì)胞和分子水平上觀察Me-Ja對ACC-2細(xì)胞株的作用,探討其可能存在的機制,為Me-Ja抗SACC作用的進一步研究提供理論以及實驗依據(jù)。

方法：1.體外培養(yǎng)ACC-2細(xì)胞,運用CCK-8法篩選茉莉酸甲酯的有效作用濃度及增值抑制率測定；倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化；透射電鏡下觀察各組細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布。

2. 應(yīng)用RT-PCR技術(shù)及免疫細(xì)胞化學(xué)SP法分別檢測各組ACC-2細(xì)胞中Bcl-2、Bax mRNA和蛋白的表達(dá)強度。

3. 實驗分組：空白對照組、5-Fu組、Me-Ja組、Me-Ja+5-Fu組。

結(jié)果：1.CCK-8法檢測各濃度梯度Me-Ja作用不同時間對ACC-2細(xì)胞增殖抑制率結(jié)果：Me-Ja對ACC-2細(xì)胞具有增殖抑制作用,這種作用隨Me-Ja作用濃度的增加、作用時間的延長而增大,呈現(xiàn)濃度和時間依賴性。

2. Me-Ja對ACC-2細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50結(jié)果：Me-Ja對ACC-2細(xì)胞半數(shù)抑制濃度IC50為9.20μmol/L。后續(xù)試驗Me-Ja濃度采用1/2IC50,即4.6μmol/L。

3. 倒置顯微鏡下觀察Me-Ja作用后ACC-2細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化結(jié)果：空白對照組：ACC-2細(xì)胞貼壁生長,細(xì)胞呈梭形、多邊形,異型性明顯。5-Fu組和Me-Ja組及聯(lián)合作用組均可見部分細(xì)胞脫落,貼壁細(xì)胞明顯減少。Me-Ja+5-Fu組脫落細(xì)胞更多,貼壁細(xì)胞數(shù)目較單藥作用組更少。

4. CCK-8法檢測各組ACC-2細(xì)胞增殖抑制率結(jié)果：5-Fu組為44.22%,Me-Ja組為44.92%,Me-Ja+5-Fu組為49.30%。5-Fu與Me-Ja單獨作用組之間相比,P>0.05,聯(lián)合作用組與單藥作用組相比P<0.05,說明5-Fu與Me-Ja單獨作用對ACC-2細(xì)胞的增值抑制率無明顯差別,聯(lián)合用藥效果優(yōu)于單獨用藥。

5. 透射電鏡下觀察各組ACC-2細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)結(jié)果：空白對照組ACC-2細(xì)胞幼稚,分化程度低,增殖力強,屬惡性腫瘤細(xì)胞的典型特征。5-Fu組和Me-Ja組及聯(lián)合作用組均可見到部分細(xì)胞表面微絨毛消失,細(xì)胞之間連接變少甚至消失,部分細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡改變,聯(lián)合作用組尤其明顯。

6. 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組ACC-2細(xì)胞周期分布結(jié)果：空白對照組：ACC-2細(xì)胞有40.8%處于G1期,有24.6%處于S期；5-Fu組：有55.9%的細(xì)胞處于G1期；17.2%的細(xì)胞處于S期；細(xì)胞阻滯于G1期；Me-Ja組：62.1%的細(xì)胞處于G1期,17.3%的細(xì)胞處于S期,細(xì)胞也阻滯于G1期；亞二倍體峰出現(xiàn),說明部分細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。Me-Ja+5-Fu組：61.2%的細(xì)胞處于G1期,僅7.1%的細(xì)胞處于S期,細(xì)胞G1期阻滯效果更明顯,典型凋亡亞二倍體峰可見,更多細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。

7. RT-PCR法檢測各組ACC-2細(xì)胞Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)結(jié)果：Me-Ja、5-Fu和Me-Ja+5-Fu分別作用48h后,ACC-2細(xì)胞內(nèi)Bcl-2mRNA的表達(dá)水平相對空白對照組均明顯下降(P<0.05),而Bax mRNA的表達(dá)水平相對空白對照組明顯升高(P<0.05)。

8. 免疫細(xì)胞化學(xué)SP法檢測Bcl-2和Bax蛋白結(jié)果：Me-Ja、5-Fu和Me-Ja+5-Fu分別作用48h后,各實驗組ACC-2細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白在胞漿中表達(dá)水平均明顯低于對照組(p<0.05),而Bax蛋白的表達(dá)水平較對照組也明顯增加(P<0.05)。

參考文獻(xiàn)

[1]Jasmonates induce nonapoptotic death in high‐resistance mutant p53‐expressing B‐lymphoma cells.OritFingrut;DoritReischer;RonitRotem;NataliaGoldin;IritAltboum;IsraelZan‐Bar;EliezerFlescher.British Journal of Pharmacology,2009

[2]Effects of natural and novel synthetic jasmonates in experimental metastatic melanoma.DReischer;AHeyfets;SShimony;JNordenberg;YKashman;EFlescher.British Journal of Pharmacology,2009

[3]PI3K/Akt Pathway Activation Attenuates the Cytotoxic Effect of Methyl Jasmonate Toward Sarcoma Cells.Uri Elia;;Eliezer Flescher.Neoplasia,2008

[4]Methyl jasmonate induces cell death with mixed characteristics of apoptosis and necrosis in cervical cancer cells.Tatiana Kniazhanski;;Anna Jackman;;Alina Heyfets;;Pinhas Gonen;;Eliezer Flescher;;Levana Sherman.Cancer Letters,2008

[5]趙海東.茉莉酸甲酯對人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞生長抑制作用及其機制的實驗研究[D].鄭州大學(xué),2013.