背景^[1-3]

人甲狀腺鱗癌細(xì)胞源于一位59歲的白人男性患者的甲狀腺鱗癌組織；人甲狀腺鱗癌細(xì)胞在裸鼠中成瘤(產(chǎn)生Ⅲ級(jí)惡性紡錘狀巨細(xì)胞瘤)。

人甲狀腺鱗癌細(xì)胞

人甲狀腺鱗癌細(xì)胞培養(yǎng)步驟：

人甲狀腺鱗癌細(xì)胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

L-15培養(yǎng)基，90%；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%。培養(yǎng)條件：氣相：空氣，100%。溫度：37攝氏度。

凍存液：90%完全培養(yǎng)基，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲(chǔ)存。

人甲狀腺鱗癌細(xì)胞處理：

復(fù)蘇人甲狀腺鱗癌細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

人甲狀腺鱗癌細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.用75%酒精噴灑整個(gè)培養(yǎng)瓶消毒，將其平躺置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行1-3小時(shí)的緩沖，.然后置于無菌操作臺(tái)，打開瓶口，將其中的培養(yǎng)液去掉，再往其中加入5-6mL新鮮培養(yǎng)基(以T25培養(yǎng)瓶為例)并置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況及培養(yǎng)基顏色變化對(duì)其進(jìn)行換液以及傳代，一般2到3天換一次液；

2.待細(xì)胞長(zhǎng)至80-90%時(shí)，需要對(duì)其進(jìn)行傳代，推薦傳代比例為1:3至1:5；

3傳代步驟：將0.25%胰酶-0.53 mM EDA消化液置于37°預(yù)熱，倒掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，往培養(yǎng)瓶中加入3-5 ml PBS，輕晃洗滌后棄去。往瓶中加1-2 ml預(yù)熱好的胰酶，置于37°孵育消化（次消化需時(shí)常取出置于顯微鏡下觀察，以顯微鏡下細(xì)胞觸角回收變圓、輕拍瓶壁見細(xì)胞脫落為消化時(shí)間，記錄消化時(shí)間，以便于下次消化），消化好后加入3ml完全培養(yǎng)基終止消化。用移液槍輕輕吹打瓶壁上的細(xì)胞，使之完全脫落，然后收集細(xì)胞懸液，1200rpm離心5min，棄上清，加入完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，進(jìn)行傳代。

3）人甲狀腺鱗癌細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入約1ml含血清的培養(yǎng)基后加入凍存管中，再添加10%DMSO后進(jìn)行凍存。

應(yīng)用^[4][5]

人甲狀腺鱗癌細(xì)胞可以用于線粒體分裂在甲狀腺鱗癌細(xì)胞SW579細(xì)胞增殖、凋亡以及侵襲中的作用

研究線粒體動(dòng)力學(xué)蛋白中融合蛋白2(Mitofusin 2,Mfn2)和動(dòng)力蛋白1(Dynamin-related protein1,Drp1)在甲狀腺鱗癌SW579細(xì)胞中的表達(dá)和線粒體分裂抑制劑-1(Mitochondrial division inhibitor 1,Mdivi-1)對(duì)SW579細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲能力的影響。

方法采用RT-PCR檢測(cè)Mfn2和Drp1 mRNA,Western blot檢測(cè)Mfn2和Drp1蛋白在Nthy-ori 3-1和SW579兩種細(xì)胞中的表達(dá)；然后將SW579分為對(duì)照組(DMSO,0.1%)和Mdivi-1低、中、高劑量組(濃度分別為15、30、45μmol/L),培養(yǎng)16 h,采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的變化,用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)各組線粒體膜電位的變化,用RT-PCR檢測(cè)各組Caspase-3 mRNA的變化,Western blot檢測(cè)各組Caspase-3蛋白的變化,用Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組侵襲能力的變化。

結(jié)果1、與Nthy-ori 3-1細(xì)胞系相比,SW579細(xì)胞系中Mfn2 mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低,Drp1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)。

2、與對(duì)照組相比,Mdivi-1低、中、高劑量組中SW579中細(xì)胞存活率,線粒體膜電位以及侵襲能力均明顯降低(P<0.01)。3、與對(duì)照組相比,Mdivi-1低、中、高劑量組中SW579細(xì)胞中Caspase-3的mRNA及蛋白表達(dá)均明顯增加(P<0.01)。

結(jié)論1、甲狀腺鱗癌SW579細(xì)胞中存在明顯的線粒體動(dòng)力學(xué)異常。

2、Mdivi-1可以濃度依賴性地抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲,誘導(dǎo)其凋亡。

參考文獻(xiàn)

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