背景^[1-3]

人胚肺成纖維細(xì)胞是由H·Kuramoto于1968年分離的HEC-1-A細(xì)胞亞株。不同于HEC-A-1的是：HEC-1-B細(xì)胞在培養(yǎng)第135天到190天之間表現(xiàn)出穩(wěn)定的生長周期，且重現(xiàn)扁平，與親本細(xì)胞系相比更具鋪路石樣。此外，HEC-1-B細(xì)胞的主要染色體組是親本細(xì)胞的兩倍。

HELF(人胚肺成纖維細(xì)胞)的基本特性：

（1）組織來源于正常人肺靜脈組織。

（2）鑒定：肌動蛋白，alpha-SMA和Desmin免疫熒光染色。

（3）原代細(xì)胞培養(yǎng)末期液氮凍存。

（4）每凍存管細(xì)胞數(shù)：500000cells/1ml。

（5）肌動蛋白，alpha-SMA和Desmin免疫熒光染色驗證。

（6）不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌。

人胚肺成纖維細(xì)胞

細(xì)胞操作：

復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加4-6mL完全培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中），培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

1.接收到，用75%的酒精消毒（建議配制75%酒精的水是滅菌過的）培養(yǎng)瓶外部。

2.肉眼觀察細(xì)胞培養(yǎng)基顏色，顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，并對細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照（建議收到時的培養(yǎng)瓶拍一張照片，顯微鏡拍收到時的細(xì)胞100X,200X各一張）。

3.嚴(yán)格無菌操作，打開細(xì)胞培養(yǎng)瓶。

4.將細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)基用吸管完全吸出（嚴(yán)禁直接傾倒）。

5.1000rpm,5min離心，重懸細(xì)胞。換新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶和新鮮培養(yǎng)基，37℃,5%CO2培養(yǎng)。

應(yīng)用^[4][5]

用于P物質(zhì)對人胚肺成纖維細(xì)胞作用及其機制的研究

探討P物質(zhì)（Substance P,SP）對人胚肺成纖維細(xì)胞（MRC-5）增殖與活化的作用及其調(diào)控機制,進(jìn)一步揭示P物質(zhì)參與肺間質(zhì)纖維化中的作用機理,為臨床治療肺間質(zhì)纖維化的藥物研究與開發(fā)提供新的思路。

方法:體外培養(yǎng)人胚肺成纖維細(xì)胞（MRC-5）,取對數(shù)生長期的細(xì)胞為研究對象,展開以下研究:（1）以系列濃度（1、10、100、1000、10000 n M）的P物質(zhì)處理MRC-5細(xì)胞,利用CCK8法檢測系列濃度的P物質(zhì)在不同時間點（24、48、72h）對MRC-5增殖活性影響。從而篩選出P物質(zhì)對MRC-5細(xì)胞的作用濃度及時間。

（2）利用天狼猩紅染色檢測系列濃度的P物質(zhì)在72h時MRC-5細(xì)胞分泌膠原纖維含量變化。

（3）使用Western blot檢測系列濃度的P物質(zhì)在72h時MRC-5細(xì)胞對α-SMA蛋白表達(dá)的影響。

（4）在此基礎(chǔ)上,我們將細(xì)胞分為三個組,分別是對照組、100 n M P物質(zhì)組（簡稱P物質(zhì)組）、100 n M P物質(zhì)+10μM L732138組（NK-1R抑制劑）（以下簡稱P物質(zhì)+L732138組）,將以上三組細(xì)胞培養(yǎng)72h后,分別以CCK8法檢測各組細(xì)胞增殖活性,用天狼猩紅染色檢測各組細(xì)胞分泌膠原纖維的含量變化,利用Western blot檢測各組細(xì)胞α-SMA蛋白表達(dá)的變化,從而闡明P物質(zhì)對MRC-5細(xì)胞的增殖及活化作用。

（5）為研究P物質(zhì)對MRC-5細(xì)胞的作用機制,將對照組、P物質(zhì)組、P物質(zhì)+L732138組三組細(xì)胞體外培養(yǎng)72h,利用Western blot檢測各組細(xì)胞TGF-β1、Smad3、p-Smad3蛋白的表達(dá)變化。

（6）為進(jìn)一步檢測SP/NK-1R在TGF-β1/Smad3信號通路中的作用,我們再次將細(xì)胞分為三個組,分別是對照組、100 n M P物質(zhì)組（簡稱P物質(zhì)組）,100 n M P物質(zhì)+10μM SB431542組（TGFβR1抑制劑）（以下簡稱P物質(zhì)+SB431542組）,分別以CCK8法檢測各組細(xì)胞增殖活性,用天狼猩紅染色檢測各組細(xì)胞分泌膠原纖維的含量變化。

結(jié)果:（1）MRC-5細(xì)胞經(jīng)系列濃度（1、10、100、1000、10000 n M）P物質(zhì)處理后,24 h后OD值無明顯變化;與對照組比較,在處理48h及72h后,100n M P物質(zhì)組細(xì)胞OD值均升高,其中以72h時OD值升高更為明顯（P<0.01）。

（2）MRC-5細(xì)胞經(jīng)系列濃度P物質(zhì)處理72 h后,與對照組比較,100 n M P物質(zhì)組處理的細(xì)胞膠原纖維含量明顯增多（P<0.001）。

（3）經(jīng)系列濃度P物質(zhì)處理72 h后,與對照組比較,10 n M P物質(zhì)組及100 n M P物質(zhì)組細(xì)胞α-SMA蛋白相對表達(dá)水平均增高,其中以100 n M P物質(zhì)組增高更為顯著（P<0.001）。

參考文獻(xiàn)

[1]Substance P and fibrotic diseases[J].Lei Peng,George O.Agogo,Jianqiang Guo,Ming Yan.Neuropeptides.2019(C)

[2]Renal fibrosis:Recent translational aspects[J].Hélène Fran?ois,Christos Chatziantoniou.Matrix Biology.2018

[3]Idiopathic pulmonary fibrosis:pathogenesis and management.[J].Sgalla Giacomo,Iovene Bruno,Calvello Mariarosaria,Ori Margherita,Varone Francesco,Richeldi Luca.Respiratory research.2018(1)

[4]Macrophage migration inhibitory factor promotes cardiac fibroblast proliferation through the Src kinase signaling pathway.[J].Xue Yu-Mei,Deng Chun-Yu,Wei Wei,Liu Fang-Zhou,Yang Hui,Liu Yang,Li Xin,Wang Zhaoyu,Kuang Su-Juan,Wu Shu-Lin,Rao Fang.Molecular medicine reports.2018(2)

[5]曾令軍.P物質(zhì)對人胚肺成纖維細(xì)胞作用及其機制的研究[D].西南醫(yī)科大學(xué),2021.