背景^[1-3]

HCT-15細胞專用培養(yǎng)基可保持HCT-15細胞的生長狀態(tài)。培養(yǎng)基中已包含HCT-15細胞生長所需的各種成分，無需添加任何成分，可直接用于HCT-15細胞的體外培養(yǎng)。

細胞培養(yǎng)操作

1）復(fù)蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?0cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.將細胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

HCT-15細胞

3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面T25瓶為類；

1.細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù)。

2.4 min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細胞，根據(jù)細胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存1ml細胞懸液，注意凍存管做好標識。

3.將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，2個小時以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4][5]

用于水蠟樹果實提取物對結(jié)腸癌HCT-15細胞的增殖、千移及凋亡誘導(dǎo)因子AIF表達的影響研究

通過體外實驗研究水蠟樹果實提取物（Fruit of Ligustrum Obtusifolium Extract,FLOE）對結(jié)腸癌HCT-15細胞的增殖、遷移及凋亡誘導(dǎo)因子（Apoptosisi Iducing Fctor,AIF）表達的影響,探討其可能的作用機制,為中藥在結(jié)腸癌治療中的研發(fā)及AIF應(yīng)用于結(jié)腸癌治療提供更多的理論依據(jù)。

方法:體外培養(yǎng)結(jié)腸癌細胞株HCT-15,取對數(shù)期細胞用于實驗。將FLOE用不完全培養(yǎng)基RPMI-1640稀釋成不同濃度:0μg/ml（對照組）、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml組,并用RPMI-1640不完全培養(yǎng)基稀釋75%酒精（20μg/ml）,設(shè)置陰性對照。

采用普通光學(xué)顯微鏡觀察在不同濃度藥物分別處理24h、48h、72h、96h后細胞形態(tài)學(xué)變化,并在顯微鏡下計算貼壁細胞數(shù)量。采用MTS法檢測不同濃度藥物分別處理24h、48h、72h、96h后,對HCT-15細胞存活率的影響。采用集落實驗檢測不同濃度FLOE對結(jié)腸癌HCT-15細胞生存能力的影響;劃痕實驗檢測在不同濃度藥物處理后,對HCT-15細胞遷移能力的影響。

采用Western bolt法檢測在不同濃度藥物作用48h后,對HC15細胞凋亡相關(guān)蛋白及AIF表達的影響。結(jié)果:隨著FLOE藥物濃度的增高及作用時間的延長,HCT-15細胞伸展變差、細胞間隙增大、空泡化、細胞漂浮,細胞計數(shù)發(fā)現(xiàn)貼壁細胞也隨之減少。MTS結(jié)果表明與對照組相比FLOE處理后的細胞存活率降低（P<0.05）,且呈時間及濃度依賴性。

劃痕實驗結(jié)果表明與對照組相比FLOE處理后的細胞劃痕區(qū)域相對寬度較寬（P<0.05）。集落實驗結(jié)果表明FLOE處理后細胞集落形成數(shù)量明顯降低,與對照組相比集落抑制率有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。Western bolt實驗結(jié)果表明隨著FLOE濃度的增高,Survivin、Mcl-1蛋白表達水平明顯降低,而凋亡誘導(dǎo)因子AIF表達增加。

結(jié)論:水蠟樹果實提取物能抑制HCT-15細胞增殖及遷移,且呈濃度及時間依賴性。其機制可能通過下調(diào)抗凋亡蛋白的表達及上調(diào)凋亡誘導(dǎo)因子AIF的表達實現(xiàn)。

參考文獻

[1]Lebein,a snake venom disintegrin,suppresses human colon cancer cells proliferation and tumor‐induced angiogenesis through cell cycle arrest,apoptosis induction and inhibition of VEGF expression[J].Ons Zakraoui,Cezary Marcinkiewicz,Zohra Aloui,Houcemeddine Othman,Renaud Grépin,Meriam Haoues,Makram Essafi,Najet Srairi‐Abid,Ammar Gasmi,Habib Karoui,Gilles Pagès,Khadija Essafi‐Benkhadir.Molecular Carcinogenesis.2017(1)

[2]Miltirone induced mitochondrial dysfunction and ROS-dependent apoptosis in colon cancer cells[J].Lin Wang,Tao Hu,Jing Shen,Lin Zhang,Long-fei Li,Ruby Lok-Yi Chan,Ming-xing Li,William Ka-Kei Wu,Chi-Hin Cho.Life Sciences.2016

[3]Risk of recurrence in patients with colon cancer stage II and III:A systematic review and meta-analysis of recent literature[J].Camilla Bö,ckelman,Bodil E.Engelmann,Tuomas Kaprio,Torben F.Hansen,Bengt Glimelius.Acta Oncologica.2015(1)

[4]Crude extract of Rheum palmatum L induced cell death in LS1034 human colon cancer cells acts through the caspase‐dependent and‐independent pathways[J].Yi‐Shih Ma,Shu‐Chun Hsu,Shu‐Wen Weng,Chien‐Chih Yu,Jai‐Sing Yang,Kuang‐Chi Lai,Jing‐Pin Lin,Jaung‐Geng Lin,Jing‐Gung Chung.Environ.Toxicol.2014(9)

[5]魯夢甜.水蠟樹果實提取物對結(jié)腸癌HCT-15細胞的增殖、千移及凋亡誘導(dǎo)因子AIF表達的影響[D].中國醫(yī)科大學(xué),2019.