背景[1-3]
ATDC5小鼠胚胎瘤細胞是來源于畸胎瘤細胞的小鼠軟骨發(fā)生細胞系，在胰島素刺激下，分化成軟骨細胞，形成軟骨小結，表達Ⅱ型膠原和X型膠原最后發(fā)生礦化，反映軟骨發(fā)生過程。
ATDC5小鼠胚胎瘤細胞
細胞培養(yǎng)步驟
培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：
1）準備DMEM培養(yǎng)基(DMEM，GIBCO，貨號11965-092)，90%；胎牛血清，10%。
2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：90%完全培養(yǎng)基，10%DMSO，現用現配。液氮儲存。
細胞處理：
1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或將細胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。
2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
傳代方法：
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化。
3.輕輕吹打細胞，完全脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.按5-6ml/瓶補加培養(yǎng)液，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。
應用[4][5]
用于長鏈非編碼RNA MALAT 1通過microRNA-19b抑制脂多糖誘導ATDC 5細胞損傷的作用機制研究
探討長鏈非編碼RNA轉移相關肺腺癌轉錄因子1（lncRNA MALAT 1）對脂多糖（LPS）誘導的小鼠軟骨祖細胞（ATDC5）炎癥損傷的影響,并探討其可能機制。
研究方法1、LPS誘導ATDC5細胞凋亡和炎性損傷。在DMEM/F12中培養(yǎng)ADTC5細胞,應用LPS進行處理。采用細胞計數試劑盒-8（CCK-8）法測定不同濃度LPS處理后的ATDC5細胞活性。采用AnnexinV-PE染色法檢測不同濃度LPS處理后的ATDC5細胞凋亡。應用Western blotting方法檢測不同濃度LPS處理后凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax\Pro-caspase3、Cleaved-caspase3、Pro-caspase9和Cleaved-caspase9的表達。分別用定量逆轉錄PCR（qRT-PCR）和Western blotting方法檢測LPS處理后ATDC5細胞中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA和蛋白表達。應用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測LPS處理后ATDC5細胞培養(yǎng)上清中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的濃度。
2、LPS處理后ATDC 5細胞中MALAT1的表達。用定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測LPS處理后ATDC5細胞中MALAT1的表達。
3、MALAT1對LPS誘導的ATDC 5細胞炎性損傷的作用。用pEX-MALAT1和shMALAT1轉染LPS處理后的ATDC5細胞。分別用細胞計數試劑盒-8（CCK-8）法和AnnexV-pe染色法檢測LPS處理pEX-MALAT1和sh-MALAT1轉染后ATDC5細胞活性和凋亡率。用qRT-PCR檢測ATDC 5細胞中MALAT1的表達。設立對照組、LPS處理組、LPS+pEX組、LPS+pEX+MALAT1組和LPS+shNC組、LPS+sh+MALAT1組。Western blotting方法分別檢測各組Bcl-2、Bax、Pro-caspase 3、.Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9、Pro-caspase 9的表達,用qRT-PCR和Western blotting檢測各組ATDC5細胞中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA和蛋白表達。ELISA法檢測上清液中的IL-1β,IL-6、IL-8和TNF-α的濃度。
4、MALAT1對ATDC5細胞中miR-19b表達的調控。轉染pEX-MALAT1或sh-MALAT1后,用qRT-PCR方法檢測轉染后ATDC5細胞中miR-19b的表達。5、MALAT1通過miR-19b調控LPS誘導ATDC5細胞的炎癥損傷。用miR-19b抑制劑轉染ATDC5細胞。采用qRT-PCR法檢測轉染miR-19b抑制劑后ATDC5細胞中miR-19b的表達。
參考文獻
[1]A chondrogenic cell line derived from a differentiating culture of AT805 teratocarcinoma cells.Atsumi T,Miwa Y,Kimata K,Ikawa Y.Cell differentiation and development:the official journal of the International Society of Developmental Biologists.1990
[2]T Cell Factor4Is a Pro-catabolic and ApoptoticFactor in Human Articular Chondrocytes by Potentiating Nuclear Factor kB Signaling.Ma B,Zhong L,van Blitterswijk CA,et al.Journal of Biological Chemistry.2013
[3]The long noncoding RNA MALAT1regulates the lipopolysaccharide-induced inflammatory response through its interaction with NF-kB.Zhao G,Su Z,Song D,et al.FEBS Letters.2016
[4]microRNA-9 regulates survival of chondroblasts and cartilage integrity by targeting protogenin.J.Song,D.Kim,C.-H.Chun,E.-J.Jin.Cell Communication and Signaling.2013
[5]潘琳.長鏈非編碼RNA MALAT 1通過microRNA-19b抑制脂多糖誘導ATDC 5細胞損傷的作用機制[D].山東大學,2018.