普卡那肽（Prucalopride）是一種用于治療慢性便秘的多肽類藥物，屬于選擇性 5 - 羥色胺 4（5-HT4）受體激動劑。其制備過程涉及多肽合成、純化及結(jié)構(gòu)修飾等步驟，以下是其核心制備方法及關(guān)鍵技術(shù)要點的詳細解析：
一、基本化學結(jié)構(gòu)與合成策略
1. 化學結(jié)構(gòu)
普卡那肽的分子式為 C29H41N5O4S，相對分子質(zhì)量約 541.73，結(jié)構(gòu)包含：
N 端：焦谷氨酸（pGlu，環(huán)化谷氨酸）
核心肽鏈：Pro-Ile-Asp-Phe-NH?（脯氨酸 - 異亮氨酸 - 天冬氨酸 - 苯丙氨酸酰胺）
特殊修飾：N 端焦谷氨酸的環(huán)化結(jié)構(gòu)，需通過化學環(huán)化反應實現(xiàn)。
2. 合成策略
方法選擇：因含環(huán)化結(jié)構(gòu)，通常采用固相多肽合成法（SPPS），便于在樹脂上進行環(huán)化反應，減少副產(chǎn)物生成。
關(guān)鍵步驟：
氨基酸偶聯(lián)：從 C 端（苯丙氨酸酰胺）向 N 端延伸，逐步連接 Asp、Ile、Pro。
焦谷氨酸環(huán)化：N 端谷氨酸的 α- 氨基與側(cè)鏈羧基環(huán)化形成五元環(huán)（焦谷氨酸結(jié)構(gòu)）。
裂解與純化：從樹脂上裂解肽鏈，通過高效液相色譜（HPLC）純化獲得目標產(chǎn)物。
二、具體制備步驟與技術(shù)細節(jié)
1. 樹脂選擇與 C 端起始
樹脂類型：選用 Rink Amide MBHA 樹脂（氨基樹脂），便于 C 端直接形成酰胺結(jié)構(gòu)（Phe-NH?）。
活化方式：
苯丙氨酸（Phe）通過 Fmoc（9 - 芴甲氧羰基）保護氨基，用 HATU（2-(7 - 偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'- 四甲基脲六氟磷酸鹽）和 DIEA（N,N - 二異丙基乙胺）活化羧基，與樹脂氨基偶聯(lián)。
反應條件：室溫下振蕩 2 小時，用茚三酮顯色法檢測偶聯(lián)完全性。
2. 氨基酸鏈延伸（Asp→Ile→Pro）
脫保護：用 20% 哌啶 / DMF 溶液脫去 Fmoc 保護基，露出 α- 氨基。
偶聯(lián)反應：
天冬氨酸（Asp）需用 tBu（叔丁基）保護側(cè)鏈羧基，異亮氨酸（Ile）和脯氨酸（Pro）用 Fmoc 保護氨基，依次通過 HATU/DIEA 活化偶聯(lián)。
每步偶聯(lián)后用乙酸酐 / 吡啶溶液封端未反應氨基，減少副產(chǎn)物。
3. 焦谷氨酸（pGlu）環(huán)化
環(huán)化前處理：脫去 N 端谷氨酸的 Fmoc 保護基，保留側(cè)鏈羧基保護基（如 Trt，三苯甲基）。
環(huán)化反應：
使用 EDC?HCl（1 - 乙基 - 3-(3 - 二甲基氨基丙基) 碳二亞胺鹽酸鹽）和 HOBt（1 - 羥基苯并三唑）催化，在 DMF 中室溫反應 12-16 小時，促使 α- 氨基與側(cè)鏈羧基脫水環(huán)化形成焦谷氨酸。
關(guān)鍵控制：反應 pH 需維持在 4.5-5.5（用 HOAc 調(diào)節(jié)），避免過度環(huán)化或消旋化。
4. 樹脂裂解與粗肽釋放
裂解試劑：采用 TFA（三氟乙酸）/H?O/TIS（三異丙基硅烷）=95:2.5:2.5（體積比）的混合液，室溫下反應 2 小時，斷裂肽鏈與樹脂的連接鍵（如 Wang 樹脂的酯鍵）。
沉淀與洗滌：裂解液用冷乙醚沉淀，離心后收集粗肽，用乙醚洗滌 3 次除去 TFA 等雜質(zhì)。
5. 純化與結(jié)構(gòu)確證
純化方法：
反相 HPLC：使用 C18 柱，流動相為乙腈 / 水（含 0.1% TFA）梯度洗脫，收集目標峰（保留時間需與標準品一致）。
冷凍干燥：純化后的肽溶液經(jīng)冷凍干燥得到白色粉末狀成品。
結(jié)構(gòu)確證：
質(zhì)譜（MS）：檢測分子離子峰（[M+H]+≈542.3），確認分子量。
核磁共振（NMR）：分析 ¹H-NMR 和 ¹³C-NMR 譜圖，驗證氨基酸序列及環(huán)化結(jié)構(gòu)。
HPLC 純度檢測：要求主峰純度≥99.0%，單一雜質(zhì)≤0.1%。