還在為免疫蛋白印跡（Western Blot，WB）條帶深淺不一抓狂嗎？實驗結(jié)果總像開盲盒？問題很可能出在內(nèi)參蛋白沒選對！別擔(dān)心，這篇指南專為實驗萌新打造，手把手教你選對內(nèi)參，讓數(shù)據(jù)穩(wěn)如泰山！

1. 內(nèi)參蛋白是什么？為什么它如此重要？

想象一下：你想測量兩杯水的多少，但每次倒水的杯子大小都不一樣（有時用大杯，有時用小杯），這樣比較還有意義嗎？當然沒有！內(nèi)參蛋白就是實驗中的“標準杯”。它是在你的實驗條件下（比如藥物處理、基因敲除等），表達量穩(wěn)定不變的“看家蛋白”。

它的核心作用：

1. 校正上樣量：確保你每次加到膠孔里的蛋白總量是一致的。
2. 校正操作誤差：彌補實驗過程中轉(zhuǎn)膜、顯影等步驟帶來的微小差異。
3. 量化目標蛋白：只有把目標蛋白的信號與內(nèi)參蛋白的信號進行比較（比如計算比值），得到的相對表達量變化才真實可靠！

簡單說：沒有可靠的內(nèi)參，你的實驗結(jié)果可信度大打折扣！

2. 如何選擇“靠譜”的內(nèi)參蛋白？（小白速成四步法）

第一步：確定你的實驗樣本類型，不同的樣本，其“看家”蛋白可能完全不同！

動物細胞/組織，最常見的選擇有：

1. β-Actin(肌動蛋白，42KDa)：廣泛分布于細胞漿內(nèi)，表達量豐富，占細胞總蛋白的50%，應(yīng)用最廣，但注意！在高增殖/代謝活躍的細胞（如癌細胞、肌肉細胞）或涉及細胞骨架變化的實驗中，它可能不穩(wěn)定！
2. GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶，37KDa)：糖酵解關(guān)鍵酶，在所有組織細胞中高表達，表達量基本恒定。但涉及代謝（如糖、氧水平改變）、高增殖細胞的實驗要小心，它也可能變！
3. Tubulin(微管蛋白，50KDa)：α-Tubulin,β-Tubulin。作為細胞骨架蛋白，表達穩(wěn)定，常用于免疫熒光觀察細胞的微管結(jié)構(gòu)。同樣要注意細胞骨架動態(tài)變化的實驗。
4. 其他可靠選擇：Vinculin, COX IV (線粒體標記), Lamin B1 (核膜蛋白), Histone H3(組蛋白-核內(nèi)蛋白)。當上述常用內(nèi)參不穩(wěn)定時，這些是很好的備選。

植物樣本：動物常用的內(nèi)參在植物里往往不適用！

1. Rubisco(大亞基)：光合作用關(guān)鍵酶，在綠葉組織中非常豐富穩(wěn)定。
2. Actin(植物肌動蛋白)：類似動物Actin，但需使用植物特異性抗體。
3. Tubulin(植物微管蛋白)：類似動物Tubulin。
4. 其他：Ubiquitin,EF-1α(延伸因子)。

細菌樣本：動物/植物內(nèi)參基本無效！

1. RNA聚合酶亞基(如RpoB/RpoC)：常用且穩(wěn)定。
2. Gyrase(如GyrB)：DNA解旋酶亞基。
3. EF-Tu(延伸因子)：參與蛋白質(zhì)合成。

特定亞細胞結(jié)構(gòu)：如果你研究的是線粒體、細胞核、細胞膜等特定部位的蛋白，需要選擇該部位特異性的內(nèi)參！

1. 線粒體：COX IV, VDAC1, SDHA。
2. 細胞核：Lamin A/C, Lamin B1, Histone H3, PCNA (注意增殖狀態(tài))。
3. 細胞膜：Na?/K? ATPase。
4. 細胞漿：GAPDH, β-Actin, Tubulin (但需確認目標蛋白是否也在胞漿)。

第二步：查閱文獻！查閱文獻！查閱文獻！

重要的事情說三遍！這是最快捷、最可靠的方法。

怎么做？在PubMed、Google Scholar等數(shù)據(jù)庫搜索：

1. 你的研究領(lǐng)域/疾病+你的目標蛋白 + AND western blot
2. 你的細胞類型/組織類型 + housekeeping protein
3. 你的細胞類型/組織類型 + loading control

看什么？看看和你做類似研究、用類似樣本的大佬們，他們用的是什么內(nèi)參？通常選擇被廣泛使用和驗證的內(nèi)參會更保險。

第三步：考慮你的實驗處理因素

你的實驗操作會不會影響內(nèi)參蛋白？

1. 例如：研究代謝疾病或能量應(yīng)激？GAPDH可能不穩(wěn)定！
2. 例如：研究細胞周期或細胞遷移？β-Actin、Tubulin可能受影響！
3. 例如：研究藥物處理？要確保藥物不會影響你選的內(nèi)參的表達！
4. 黃金法則：理想的內(nèi)參蛋白應(yīng)該完全不受你的實驗處理影響！

第四步：驗證！驗證！再驗證！

選定了內(nèi)參蛋白后，絕對不能直接默認它在你的實驗條件下是穩(wěn)定的！

怎么做驗證？

1. 在你的實驗體系中（例如，對照組vs.處理組），同時跑目標蛋白和候選內(nèi)參蛋白。
2. 比較不同組之間內(nèi)參蛋白條帶的信號強度。
3. 理想情況：各組的條帶亮度應(yīng)該非常接近，條帶粗細均勻一致。
4. 可以用軟件分析灰度值，看組間差異是否顯著（正常情況下應(yīng)該不顯著）。

如果內(nèi)參不穩(wěn)定怎么辦？回到第二步和第三步，嘗試其他候選內(nèi)參蛋白，直到找到一個在你的實驗條件下真正穩(wěn)定的為止。有時需要嘗試2-3個才能找到最合適的。

3. 選擇內(nèi)參蛋白的實用小貼士

分子量差異：確保你選的內(nèi)參蛋白的分子量與你研究的目標蛋白分子量有明顯差異，分子量最好相差5kd以上。這樣在PVDF/NC膜上，不會因為條帶重疊從而影響結(jié)果判讀和定量。（例如：目標蛋白50kDa，選個40kDa或70kDa的內(nèi)參就比選個48-52kDa的好）。

抗體質(zhì)量：購買經(jīng)過驗證、口碑好的內(nèi)參蛋白抗體。劣質(zhì)抗體是實驗失敗的常見元兇！因此購買抗體錢應(yīng)查看供應(yīng)商提供的驗證數(shù)據(jù)（如不同細胞系/組織中的特異性條帶圖）。

組織樣本特殊性：全組織提取物成分復(fù)雜。例如肌肉組織中肌動蛋白含量極高，可能需要選擇其他內(nèi)參（如GAPDH、Vinculin）。脂肪組織、腦組織等也有其特殊性，要查文獻。

考慮表達豐度：內(nèi)參蛋白在樣本中應(yīng)該有足夠高的表達量，能產(chǎn)生清晰、易檢測的信號。表達量太低的內(nèi)參，信號弱且不穩(wěn)定，不適合做參照。

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