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武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司

主營(yíng)產(chǎn)品:主要產(chǎn)品為流式抗體、細(xì)胞功能檢測(cè)試劑盒、代謝測(cè)定試劑盒、ELISA試劑盒、蛋白抗體類試劑

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揭開(kāi)效應(yīng) CD8 + T 細(xì)胞分型檢測(cè)的神秘面紗,Elabscience助力科研新突破

發(fā)布日期:2025/5/30 15:21:39發(fā)布人:武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司

在免疫系統(tǒng)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中,效應(yīng)CD8+ T細(xì)胞猶如訓(xùn)練有素的特種兵,精準(zhǔn)識(shí)別并清除被病毒感染的細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞,是宿主防御機(jī)制中的關(guān)鍵力量。今天Elabscience將介紹效應(yīng)CD8+ T細(xì)胞的分型檢測(cè)方法,助力科研人員深入探究免疫反應(yīng)的機(jī)制!

一、背景介紹

作為T細(xì)胞的一個(gè)主要亞群,細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CD8+ T細(xì)胞)在宿主防御病毒感染和清除腫瘤細(xì)胞等免疫反應(yīng)進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。在免疫反應(yīng)中,初始CD8+ T細(xì)胞能夠特異性識(shí)別抗原提呈細(xì)胞(如DC細(xì)胞)表面的MHC I-抗原肽類復(fù)合物并被激活。進(jìn)而分化為效應(yīng)CD8+ T細(xì)胞。效應(yīng)CD8+ T細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性并分泌多種細(xì)胞因子。根據(jù)分泌細(xì)胞因子的不同、細(xì)胞毒性的強(qiáng)弱以及功能的不同,效應(yīng)CD8+ T細(xì)胞可細(xì)分為不同的效應(yīng)亞型,其中主要的三類效應(yīng)亞型為:

 Tc1細(xì)胞(Type 1 Cytotoxic T Cells):主要分泌分泌IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子,關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子為T-bet,通過(guò)IFN-γ激活巨噬細(xì)胞,增強(qiáng)其對(duì)胞內(nèi)細(xì)菌(如結(jié)核分枝桿菌)和病毒的清除能力。可促進(jìn)Th1型免疫反應(yīng),是抗腫瘤免疫的核心效應(yīng)細(xì)胞。

Tc2細(xì)胞(Type 2 Cytotoxic T Cells):主要分泌IL-4、IL-5、IL-13等細(xì)胞因子,IL-4/IL-13可激活嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞,幫助清除蠕蟲(chóng)等寄生蟲(chóng)。

Tc17 (Type 17 Cytotoxic T Cells):主要分泌IL-17A、IL-17F、IL-22等細(xì)胞因子,IL-17促進(jìn)中性粒細(xì)胞募集,對(duì)抗白色念珠菌、金黃色葡萄球ju等。過(guò)度活化的Tc17可促進(jìn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化等自身免疫疾病。

那么在研究中,我們?nèi)绾螛?gòu)建TC1/TC2/TC17細(xì)胞模型并對(duì)這些效應(yīng)亞型進(jìn)行鑒定呢?在此,小E老師為大家提供TC1/TC2/TC17效應(yīng)亞型的體外誘導(dǎo)及鑒定方案。

 

二、實(shí)驗(yàn)方案

A. 樣本處理:

1) 將小鼠斷脊椎處死后浸泡在酒精中,拿至細(xì)胞房進(jìn)行樣本處理。制備單細(xì)胞懸液:在70 μm細(xì)胞篩網(wǎng)(底部可以稍微懸空)上研磨小鼠脾臟,以預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞篩網(wǎng),收集細(xì)胞懸液于15 mL離心管中,300×g,離心5 min。

2) 用1 mL 分選buffer將脾臟細(xì)胞重懸,細(xì)胞懸液用70 μm細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾于2 mL EP管,稀釋后計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度為2×108 cells/mL。

 

B. 初始 CD8+T細(xì)胞分選實(shí)驗(yàn)步驟:

1) 取1 mL細(xì)胞懸液,加入10 μL的FC封閉抗體和10 μL抗體混合物。室溫孵育10 min。加入磁珠100 μL,室溫孵育5 min。加入分選buffer到2.5 mL。

2) 使用磁力架進(jìn)行磁吸2.5 min。拿起磁極,以一個(gè)連續(xù)的動(dòng)作翻轉(zhuǎn)磁極和試管,傾倒富集的細(xì)胞懸液至一個(gè)新的試管中。計(jì)數(shù)離心后使用PBMC培養(yǎng)基重懸。

 

C. 初始 CD8+T細(xì)胞分選后流式檢測(cè)實(shí)驗(yàn)步驟:

3) 對(duì)未分選細(xì)胞懸液以及分選后上清細(xì)胞懸液進(jìn)行染色。取100 μL樣品,每管加入CD8/CD62L/CD44/CD3抗體各5 μL,4℃孵育30 min。

4) 加1 mLPBS,混勻,300×g離心5 min,去上清,加200 μL PBS重懸,直接上機(jī)檢測(cè)。

 

D. 上機(jī)操作:停止條件設(shè)置為采集90 μL細(xì)胞懸液,閾值FSC-H大于4000,分析陽(yáng)性T+細(xì)胞群比例即為分選純度。

E. 活化誘導(dǎo)效應(yīng)CD8+T細(xì)胞:

1) 用完全培養(yǎng)基(自備)將樣本制備成單細(xì)胞懸液,并調(diào)整細(xì)胞密度為 1-2×10 6 /mL。 注:細(xì)胞密度不可過(guò)高,最大密度不超過(guò) 2×10 6個(gè)/mL,細(xì)胞密度過(guò)高會(huì)影響細(xì)胞的激活效率;關(guān)注細(xì)胞狀態(tài),對(duì)于新鮮制備的原代細(xì)胞,先觀察確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)良好后再誘導(dǎo)檢測(cè)。

2) 加入對(duì)應(yīng)的單抗和蛋白進(jìn)行刺激誘導(dǎo)72 h。

實(shí)驗(yàn)分組

誘導(dǎo)方案

Tc1/Tc17

加入CD3/CD28磁珠活化IL-6(50 ng/ml)

IL-2(8 ng/ml)

TGF-β(3 µg/mL)

Tc2

加入CD3/CD28磁珠活化IL-4(20 ng/ml)

IL-2(8 ng/ml)

anti-IFN-γ(5 µg/mL)

Control

加入CD3/CD28磁珠活化

F. Tc1/Tc2/Tc17細(xì)胞檢測(cè)方案:

1) 每1 mL 細(xì)胞懸液中,加入 2 μL 的 500×Cell Stimulation MIX,于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育細(xì)胞0.5-1 h;

2) 每1 mL 細(xì)胞懸液中,加入1 μL 1000×Protein Transport Inhibitor MIX,于 37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育5-6 h。

3) 收集細(xì)胞,300×g離心5 min,棄去上清液。每組加180 μL PBS重懸細(xì)胞,按照Fixation Buffer:樣本=1:3的比例加入60 μL Fixation Buffer,輕輕吹打混勻,4°C靜置過(guò)夜固定或室溫固定1小時(shí)。

4) 固定后的細(xì)胞會(huì)沉降至EP管底部,不用離心,小心吸棄部分上清(避免吸到細(xì)胞),加入1-2 mL 1× Permeabilization Buffer,輕輕吹打混勻,500×g離心5 min,棄上清。注:液體盡量吸棄干凈,不要有殘留,吸棄上清時(shí)不要吸到細(xì)胞沉淀。

5) 各組加入100 μL 1× Permeabilization Buffer重懸細(xì)胞沉淀,每組直接加入對(duì)應(yīng)抗體,室溫避光孵育60 min(每15-20min混勻一次)。

6) 孵育完成后,各組加入1-2 mL PBS,輕輕吹打混勻,500×g離心5 min,棄上清。

7) 各組加入100-200 μL PBS重懸細(xì)胞沉淀,流式上機(jī)檢測(cè)。

 

G. 上機(jī)操作:停止條件設(shè)置為采集90 μL細(xì)胞懸液,閾值FSC-H大于4000,分析Tc1(CD3+CD8+IFN-γ+)、Tc2(CD3+CD8+IL-4+)、Tc17

(CD3+CD8+IL-17A+)細(xì)胞群比例。

 

染色方案如下

 

三、結(jié)果展示

 

圖1. Mouse naïve CD8+T細(xì)胞分選前后結(jié)果

 

圖2. 對(duì)照組和誘導(dǎo)組進(jìn)行Tc1/Tc2/Tc17流式檢測(cè)

四、常見(jiàn)問(wèn)題與解決方案

五、核心應(yīng)用場(chǎng)景

1. 腫瘤免疫治療

  • Tc1(IFN-γ+)比例高的患者對(duì)PD-1/CTLA-4抑制劑響應(yīng)更佳(如黑色素瘤)。

  • Tc17(IL-17+)在部分癌種(如結(jié)腸癌)中可能促進(jìn)免疫抑制微環(huán)境。

2. 感染性疾病

病原體特異性免疫評(píng)估:

Ø Tc1主導(dǎo)抗病毒免疫。

Ø Tc2通過(guò)IL-4協(xié)調(diào)嗜酸性粒細(xì)胞應(yīng)答。

Ø Tc17通過(guò)IL-17激活中性粒細(xì)胞防御。

疫苗開(kāi)發(fā):評(píng)估疫苗誘導(dǎo)的Tc1記憶細(xì)胞形成(如mRNA疫苗)。

3. 自身免疫病研究

  • 多發(fā)性硬化(MS)患者腦脊液中Tc17浸潤(rùn)與疾病活動(dòng)度正相關(guān)。

  • 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)中Tc1/Tc17失衡促進(jìn)關(guān)節(jié)破壞。

  • 靶向IL-17A(司庫(kù)奇尤單抗)可抑制Tc17的致病作用。

4. 移植免疫監(jiān)測(cè)

  • 供體效應(yīng)CD8+ T細(xì)胞中Tc1比例升高預(yù)示急性GVHD風(fēng)險(xiǎn)。

  • 調(diào)節(jié)性CD8+ T細(xì)胞(與Tc2相關(guān))可能促進(jìn)耐受。

 

六.效應(yīng)CD8+T細(xì)胞分型檢測(cè)Elabscience®相關(guān)試劑推薦:

名稱

貨號(hào)

Mouse CD3/CD28 T Cell Activation Beads

MIM001A

Elab Fluor® Violet 450 Anti-Mouse CD8a

APC Anti-Mouse CD3

Elab Fluor® 488 Anti-Human/Mouse CD44

PE Anti-Mouse CD62L

FITC Anti-Mouse CD4

PerCP Anti-Mouse CD3

PE Anti-Mouse IFN-γ

APC Anti-Mouse IL-4

PE/Cyanine7 Anti-Mouse IL-17

 

以上就是效應(yīng)CD8+ T細(xì)胞分型檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)方案及應(yīng)用介紹,如有相關(guān)問(wèn)題歡迎留言!我們將繼續(xù)帶來(lái)T細(xì)胞檢測(cè)干貨,請(qǐng)持續(xù)關(guān)注~


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