背景^[1-3]

小鼠骨粘連蛋白(ON)ELISA試劑盒采用雙抗體夾心兩步法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。在預(yù)包被抗小鼠骨粘連蛋白(ON)抗體（固相抗體）的微孔酶標(biāo)板中，加入小鼠骨粘連蛋白(ON)校準(zhǔn)品和待測樣本，再加入生物素標(biāo)記抗體，經(jīng)過溫育與充分洗滌后，再加入HRP偶聯(lián)的親和素，經(jīng)過溫育與充分洗滌，去除未結(jié)合的組分，在微孔板固相表面形成固相抗體-抗原-生物素標(biāo)記抗體-親和素酶的夾心復(fù)合物。加顯色液TMB，產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物，在終止液作用下，最終轉(zhuǎn)化為黃色，在酶標(biāo)儀450nm波長上測定吸光度（OD值），吸光度（OD值）與待測樣品中小鼠骨粘連蛋白(ON)的濃度正相關(guān)。擬合校準(zhǔn)品曲線，可以計算出樣本中小鼠骨粘連蛋白(ON)的濃度。

小鼠骨粘連蛋白(ON)ELISA試劑盒

小鼠骨粘連蛋白(ON)ELISA試劑盒樣品的準(zhǔn)備和保存：

細(xì)胞培養(yǎng)上清—離心去除沉淀，立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。

血清—用干凈試管收集血液，室溫凝固30分鐘，離心2000×g 20分鐘，收集血清。立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。

血漿—采用肝素、檸檬酸鹽或EDTA抗凝，抽血后30分鐘內(nèi)在2-8℃離心2000×g 20分鐘。為消除血小板的影響，建議在2-8℃進(jìn)一步離心10000×g 10分鐘。立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。

細(xì)胞裂解液—對于貼壁細(xì)胞，去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。加入適量裂解液，用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。通常10秒后，細(xì)胞就會被裂解。對于懸浮細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。加入適量裂解液，用槍吹打把細(xì)胞吹散，用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞。充分裂解后，10000—14000×g離心3-5分鐘，取上清。立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。

尿液—用無菌管收集，離心2000×g 20分鐘。仔細(xì)收集上清。如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

小鼠骨粘連蛋白(ON)ELISA試劑盒操作程序：

1、所有試劑和組分都先恢復(fù)到室溫，標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣品，建議做復(fù)孔。

2、按前面說明書描述的方法，配制好試劑盒各種組分的工作液。

從鋁箔袋中取出所需板條，剩余的板條用自封袋密封放回冰箱。

3、設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣本稀釋液孔、空白孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL，樣本稀釋液孔加樣本稀釋液50μL，空白孔不加，樣本孔加待測樣本50μL。除空白孔外，每孔加入生物素抗體100uL，用封板膜蓋住反應(yīng)板，37℃水浴鍋或恒溫箱避光溫育60min。

4、揭開封板膜，棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)5次。若使用自動洗板機，請按洗板機操作程序進(jìn)行洗板，添加浸泡30s的程序，可以提高檢測的精度。洗板結(jié)束，加底物前，要在干凈不掉屑的紙上，充分拍干反應(yīng)板。

5、除空白孔外，每孔加入HRP標(biāo)記親和素100uL，用封板膜蓋住反應(yīng)板，37℃水浴鍋或恒溫箱避光溫育20min。

6、重復(fù)步驟4。

7、所有孔中加入底物顯色液100μL。用封板膜蓋住反應(yīng)板，37℃水浴鍋或恒溫箱避光溫育15min。

8、所有孔加入終止液50μL，在450nm波長酶標(biāo)儀上讀取各孔吸光度（OD值）。

應(yīng)用^[4][5]

小鼠骨粘連蛋白(ON)ELISA試劑盒可以用于26-nor-8-羥基-α-芒柄花醇對成骨細(xì)胞活性影響的實驗研究

研究擬以玉柏石松中分離出的一種新型化合物四環(huán)三萜26-nor-8-羥基-α-芒柄花醇(26-nor-8-hydroxy-α-onocerin,簡稱26HO)為對象,研究其對體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞分裂增殖和成骨相關(guān)基因表達(dá)的影響,以期闡明其是否為治療骨折的有效成分及其治療骨損傷的分子機制。本文研究了26HO對體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞的細(xì)胞增殖、堿性磷酸酶的活性、及成骨相關(guān)基因(堿性磷酸酶ALP、骨涎蛋白BSP、I型膠原Col I、骨鈣蛋白OC、骨粘連蛋白ON、骨橋蛋白OP、轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子Runx2和Osterix)表達(dá)的影響。用組織塊改良法分離小鼠顱蓋骨成骨細(xì)胞。分離培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)正常,表現(xiàn)出較強的活性,經(jīng)鑒定為成骨細(xì)胞。MTT及小鼠骨粘連蛋白(ON)ELISA試劑盒實驗結(jié)果表明:較高濃度(20μM/L,40μM/L)26HO短期(1天)處理可以促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。長期(3天)處理對成骨細(xì)胞增殖沒有顯著影響。研究表明,26HO處理可以影響原代成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶活性?？傮w來講,隨著培養(yǎng)時間的延長(從3天至14天),低濃度的26HO(5μM/L)由促進(jìn)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性逐步變?yōu)橐种谱饔?高濃度(20-40μM/L)26HO則由抑制成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性逐步變?yōu)榇龠M(jìn)作用。實時定量PCR的結(jié)果顯示,26HO短期處理(3天)會抑制成骨細(xì)胞osterix和Runx-2的表達(dá);總體來講,26HO不利于BMP-2和BSP的表達(dá),對很多其他骨相關(guān)基因表達(dá)則呈現(xiàn)出復(fù)雜性。

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