背景[1-3]
A3人T淋巴細胞白血病細胞來自Jurkat細胞系，是用Fas抗體處理Jurkat細胞，隨后有限稀釋法獲得一個細胞系。A3細胞系對Fas介導的凋亡產(chǎn)生自發(fā)抗性的比例較低，得到的亞克隆對Fas-介導的凋亡十分敏感。挑選對新霉素具有抗性的野生型A3細胞，并三次用移碼突變誘變劑ICR-191進行處理以分離具有抗Fas抗體殺傷的隱性突變體。
A3人T淋巴細胞白血病細胞
LEC1倉鼠卵巢細胞細胞的復蘇與培養(yǎng)操作步驟:
1.水浴鍋37℃預熱，并將完全培養(yǎng)基溫浴到37℃。
2.在15 mL離心管中加入5 mL以上完全培養(yǎng)基備用。
3.從液氮或-80℃冰箱中取出細胞，放入37℃水浴鍋中，快速晃動，使凍存液迅速融化。
4.用75%醫(yī)用酒精擦拭凍存管外表面。
5.在超凈臺中打開凍存管，用巴氏吸管或移液槍吸取細胞凍存懸液，轉(zhuǎn)移至先前準備的15 mL離心管中。
6.用1 mL完全培養(yǎng)基洗滌凍存管1次，收集殘留細胞至上述15 mL離心管，減少損失。
7.細胞懸液以250×g離心4 min。
8.離心后去除上清。加入1 mL完全培養(yǎng)基，輕柔吹打細胞沉淀，充分吹散、混勻。
9.將細胞平均接種到1個T25培養(yǎng)瓶或底面積相當?shù)呐囵B(yǎng)容器中。加入足量完全培養(yǎng)基，1個T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基總量不少于5 mL。
10.放入37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中。
11.復蘇次日，觀察細胞狀態(tài)，并更換新鮮的完全培養(yǎng)基或傳代。
12.之后，每2-3天更換一次完全培養(yǎng)基，直到細胞生長至80%匯合，即需傳代。
LEC1倉鼠卵巢細胞的傳代操作步驟:
1.將完全培養(yǎng)基、0.25%Trypsin-EDTA（以下簡稱胰酶）預熱至37℃。
2.吸去培養(yǎng)容器中的培養(yǎng)基。
3.用PBS(1X)（貨號：MA0015）（T25培養(yǎng)瓶加入約3 mL，T75培養(yǎng)瓶加入約6 mL）洗滌細胞2次，注意動作輕柔，清洗全面。吸去PBS。
4.加入胰酶（T25培養(yǎng)瓶加入約0.5~1 mL，T75培養(yǎng)瓶加入約1~1.5 mL），迅速鋪勻，保證充分接觸細胞表面。
5.顯微鏡下觀察消化情況，約70%~80%細胞收縮變圓后，輕拍培養(yǎng)容器外壁，使細胞脫離培養(yǎng)表面。
6.立即加入完全培養(yǎng)基（T25培養(yǎng)瓶加入約1.5~3 mL，T75培養(yǎng)瓶加入約3~4.5 mL），隨即輕搖培養(yǎng)容器，使培養(yǎng)基和胰酶迅速混勻，終止消化。
7.使用吸管或移液管吸取細胞懸液，吹打培養(yǎng)容器底面數(shù)次，盡可能將細胞都吹打下來。
8.將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中。用PBS（T25培養(yǎng)瓶加入約3 mL，T75培養(yǎng)瓶加入約4 mL）洗滌容器1次，收集殘留細胞。
9.收集的所有細胞懸液以250×g離心4 min。
10.離心后去除上清。加入1 mL完全培養(yǎng)基，輕柔吹打細胞沉淀，充分吹散、混勻。
11.將細胞按推薦傳代比例（傳第一代時可適當減少比例，如1:2~1:3）接種至適宜的培養(yǎng)容器內(nèi)。
12.搖勻細胞，放入37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中。
13.傳代次日，觀察細胞狀態(tài)。培養(yǎng)期間可參考推薦換液頻率進行換液。
14.待細胞生長至90%匯合，即需傳代或凍存。
LEC1倉鼠卵巢細胞凍存操作步驟:
1.待細胞生長至可傳代的密度，即可準備凍存。
2.細胞消化請參考細胞的傳代操作步驟1~9。
3.離心后去除上清，用適量凍存液均勻重懸細胞。
4.將細胞按比例或數(shù)量分裝至凍存管中。
5.若選用通用細胞凍存液，請在操作前將梯度降溫盒放入4℃冰箱內(nèi)預冷，細胞分裝完后將凍存管放入梯度降溫盒再放入-80℃冰箱中。
6.若選用無血清非程序細胞凍存液，請將凍存管直接分散放入-80℃冰箱中。
7.8 h后即可將細胞轉(zhuǎn)移入液氮長期保存。
應(yīng)用[4][5]
A3人T淋巴細胞白血病細胞可以用于影響顱腦創(chuàng)傷患者凝血功能療法的基礎(chǔ)與臨床研究
究采用候選策略,利用成人中重型顱腦創(chuàng)傷(moderate to severe traumatic brain injury)患者的外周血單個核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC),通過流式細胞術(shù)、Real-time q PCR技術(shù)驗證七個lnc RNA(lnc RNA4916、lnc RNA7406-2、lnc RNA1403、lnc RNA2448-11、lnc RNA7411-2、lnc RNA4551-1、lnc RNA5189-2)是否參與HS治療TBI前后單核細胞表型的變化及相關(guān)細胞因子表達的變化,篩選出與HS的免疫調(diào)節(jié)功能相關(guān)的lnc RNA。方
法:中重型顱腦創(chuàng)傷患者34例進行前瞻性研究。入選患者采用隨機數(shù)字表法隨機分為兩組:7.5%HS治療組(A組)、3%HS治療組(B組)。兩組患者采取一致的納入和排除標準,進入相應(yīng)的研究組后給予除不同濃度的HS之外相同的治療方案,采用組間相互對照及組內(nèi)治療前后自身對照,觀察其顱內(nèi)壓下降的情況、凝血纖溶指標的改變以及預后情況。在患者治療前、治療后6h及24h后從靜脈分別采集血液樣本,淋巴細胞分離液分離患者外周血單個核細胞,流式細胞術(shù)檢測單核細胞表型偏移。體外培養(yǎng)人單核細胞系(THP-1)、人B淋巴細胞系(Raji)及A3人T淋巴細胞白血病細胞,檢測lnc RNAs(lnc RNA4916、lnc RNA1403、lnc RNA2448-11、lnc RNA7411-2、lnc RNA4551-1、lnc RNA5189-2)的表達譜,篩選出只在單核細胞表達或單核細胞優(yōu)勢表達的候選lnc RNAs。RT-q PCR檢測患者外周血單個核細胞候選lnc RNAs及受其調(diào)控的編碼基因(TNF-α、IL-6、IL-1β、TGF-β、TM)的表達。
結(jié)果:7.5%HS治療可有效降低中重型顱腦創(chuàng)傷患者的顱內(nèi)壓,同時并不會破壞患者凝血功能的平衡。對經(jīng)7.5%HS與3%HS治療的中重型顱腦創(chuàng)傷患者外周血單核細胞的流式細胞分析顯示,7.5%HS可明顯抑制中重型顱腦創(chuàng)傷患者CD14++CD16+促炎亞型單核細胞的增加。RT-q PCR檢測結(jié)果顯示7.5%高滲鹽水可抑制中重型顱腦創(chuàng)傷患者外周血單核細胞lnc RNA2448-11和lnc RNA1403的表達并影響其靶基因的轉(zhuǎn)錄。
參考文獻
[1]Therapeutic hypothermia and targeted temperature management in traumatic brain injury:Clinical challenges for successful translation[J].W.Dalton Dietrich;;Helen M.Bramlett.Brain Research.2016
[2]Long noncoding RNA-MEG3 is involved in diabetes mellitus-related microvascular dysfunction[J].Gui-Zhen Qiu;;Wei Tian;;Hai-Tao Fu;;Chao-Peng Li;;Ban Liu.Biochemical and Biophysical Research Communicatio,2016
[3]Traumatic brain injury advancements[J].Bellal Joseph;;Ansab Haider;;Peter Rhee.Current Opinion in Critical Care,2015(6)
[4]Long noncoding RNA:Novel links between gene expression and innate immunity[J].Susan Carpenter.Virus Research.2016
[5]楊細平.影響顱腦創(chuàng)傷患者凝血功能療法的基礎(chǔ)與臨床研究[D].天津醫(yī)科大學,2016.