介紹
植物鞘氨醇，是一種神經(jīng)鞘氨醇類化合物，其既是一類最簡單的鞘脂類化合物，又是其他鞘脂化合物的主干部分(長鏈堿基部分)，是鞘脂化合物的特征結(jié)構(gòu)。
植物鞘氨醇
應用
植物鞘氨醇在應用于化妝品中，既有可以對位于人體和其他皮膚組織中的雙鏈多脂脂質(zhì)層細胞進行皮膚滲透性功能改善的基礎同時，又同樣可以在該親水層上直接形成一個親水屏障，具有人體防護和皮膚保水的重要作用。
制備難點
目前鞘脂類的獲取方式主要有合成法以及微生物發(fā)酵法。植物中魔芋提取的神經(jīng)酰胺含量為其他植物的十幾倍。但植物提取方法受植物生長周期和季節(jié)的限制，產(chǎn)量較低。動物中來源于有致病風險的動物腦部，所以不可應用于化妝品中。而化學合成的主要是擬神經(jīng)酰胺，其結(jié)構(gòu)與神經(jīng)酰胺相似，功能相似，可應用于化妝品中，目前已有多種擬神經(jīng)酰胺成功合成，愛茉莉太平洋公司目前已生產(chǎn)出一種新型擬神經(jīng)酰胺，提高了其溶解度和穩(wěn)定性，其技術(shù)路線是將三羥甲基氨基甲烷溶于二甲基甲醛(DMF)，再溶于三乙胺(Et3N)，30min后加入棕櫚酰氯經(jīng)過一系列反應再引入脂肪酸。但因為在化妝品中應用的植物鞘氨醇主要從動植物中提取。顯然，在工業(yè)水平上是一種成本很高的方法?；瘜W合成法由于步驟繁瑣，副產(chǎn)物較多，合成率較低等缺點，難以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。生物發(fā)酵法外界干擾因素較少，可大量生產(chǎn)且降低植物鞘氨醇的價格，更利于其在產(chǎn)品中的廣泛應用[2-3]。
菌株制備法
通過釀酒酵母生產(chǎn)植物鞘氨醇的步驟為：將構(gòu)建的菌株分別在YND固體培養(yǎng)基上劃線活化，溫度30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h，單菌落接種至YPD培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30℃，轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)過夜，作為種子液；取種子液以體積濃度2％的接種量接種至30mL的YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度30℃，搖瓶轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)96h后，培養(yǎng)物離心收集沉淀。配制山梨醇緩沖液(10mL):1.82g山梨醇、0.042g檸檬酸鈉，用10mL p H 5.8的磷酸鉀緩沖液溶解，渦旋震蕩混勻，超凈臺中，濾器過濾除菌[1]。
蝸牛酶液的配置：取5mL山梨醇緩沖液加入到裝有1g蝸牛酶(廠家：索萊寶，CAS：9032?75?1)的棕色瓶中，輕輕搖動混勻，務必使蝸牛酶完全溶解，使用之前用槍頭挑一下瓶底，看是否有未溶解的酶，若有沉淀，則繼續(xù)搖動或用槍頭吹吸，使其溶解，得到的溶液為濃度是200mg/m L的蝸牛酶溶液。樣品處理：事先稱好空的2mL離心管的重量，取4mL酵母發(fā)酵液(YPD液體培養(yǎng)基)，室溫10000rpm離心1min，稱好酵母細胞和離心管的重量，接著200μL無菌水洗滌菌體(吹吸重懸)，室溫10000rpm離心1min，棄上清。重復洗滌2?3次。酵母細胞重懸于500μL巰基化合物中，32℃水浴15?30min，期間輕輕顛倒離心管兩三次，室溫10000rpm離心1min，棄上清。將沉淀重懸浮于500uL山梨醇緩沖液中。按照每克酵母細胞，加入40mg蝸牛酶的比例，加適量體積配制的蝸牛酶溶液到酵母細胞溶液中，37℃保溫1h。室溫10000rpm離心1min，棄上清。離心得到的沉淀用2ml乙醚/水(體積比為8:3)提取兩次，合并提取液。收集上層乙醚相，經(jīng)真空干燥后，溶解500uL甲醇，1：1加入500uL鄰苯二甲醛衍生試劑，渦旋震蕩10s，室溫避光孵15育30min，將植物鞘氨醇樣品經(jīng)0.22μm濾膜過濾后進行HPLC檢測。
所述巰基化合物的體系(30mL)：2.4mL的0.5M的EDTA，294μL的巰基乙醇，27.3mL的無菌水。在YPD培養(yǎng)基發(fā)酵96h后，代謝改造的菌株相比于出發(fā)菌株CEN.PK2?1D，植物鞘氨醇的產(chǎn)量均有提高，菌株P(guān)T06的產(chǎn)量最高，為9.52mg/g干重。
有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明在高產(chǎn)植物鞘氨醇的釀酒酵母的基礎上，構(gòu)建高效合成植物鞘氨醇的釀酒酵母工程菌株，將LCB4、SHM2、CHA1、ORM2、ELO3、SHM1基因編碼的蛋白質(zhì)的表達降低和利用組成型啟動子將TSC10、SYR2、LCB2基因編碼蛋白質(zhì)的表達提高，植物鞘氨醇搖瓶量達到9.52mg/g干重，再通過組成型啟動子將HAC1基因編碼蛋白質(zhì)的表達提高，植物鞘氨醇搖瓶量進一步提高了4.34倍，達到41.33mg/g干重，植物鞘氨醇產(chǎn)量達到為目前報道的搖瓶發(fā)酵最高產(chǎn)量。5L發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)植物鞘氨醇的產(chǎn)量達到了150.54mg/g干重，滴度為2817mg/L。
參考文獻
[1]孫杰,謝朋天,魏春等. 一種高產(chǎn)植物鞘氨醇的釀酒酵母菌株[P]. 浙江省: CN116103176A, 2023-05-12.
[2]俞載元,樸泰訓,金容震等. 植物鞘氨醇衍生物及含有其的組合物[P]. 韓國: CN107567457B, 2020-07-03.
[3]M.施瓦布 ,M.巴鮑 ,D.費希爾 , et al. 生產(chǎn)植物鞘氨醇或二氫神經(jīng)鞘氨醇的方法[P]. 日本: CN108473968A, 2018-08-31.