背景[1-3]
牛脂多糖結合蛋白(LBP)ELISA試劑盒可以用于檢測樣本中牛脂多糖結合蛋白(LBP)的含量。
原理：往預先包被牛脂多糖結合蛋白(LBP)捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的牛脂多糖結合蛋白(LBP)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
牛脂多糖結合蛋白(LBP)
操作步驟
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；
3.樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。
4.除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
每孔加入終止液50μL，15min內，在450nm波長處測定各孔的OD值。
應用[4][5]
用于重組牛脂多糖結合蛋白對脂多糖誘導奶牛乳腺上皮細胞炎癥反應的影響及其機制研究
通過原核表達,重組牛脂多糖結合蛋白（recombinant bovine lipopolysaccharide binding protein,rbLBP）和點突變脂多糖結合蛋白（rbM-LBP）。在乳腺上皮細胞體外培養(yǎng)基礎上,利用脂多糖（LPS）誘導奶牛乳腺上皮細胞,建立了乳腺上皮細胞炎癥反應模型。同時采用基因芯片技術對炎癥反應模型差異表達基因進行分析,探討了LPS誘導炎癥反應的關鍵因子及信號通路。并進一步通過不同濃度的rbLBP及不同的LBP作用于炎癥反應模型,探討LBP影響炎癥反應的作用及其分子機制,為LBP的應用及防治牛乳腺炎提供一定的參考依據(jù)。
方法：1.LBP載體制備、重組蛋白表達與純化根據(jù)已知牛LBP基因序列及LBP第二外顯子發(fā)生點突變的基因序列構建目的基因,并建立目的基因載體質粒pET22b,通過BL21大腸桿菌細胞為宿主的表達系統(tǒng),IPTG誘導表達后純化,得到高純度的重組牛LBP蛋白和rbM-LBP蛋白,去除內毒素,通過免疫印跡分析鑒定重組蛋白。
結果表明,本試驗成功構建了載體質粒pET22b（+）-LBP和pET22b（+）-rbM-LBP,通過BL21大腸桿菌細胞表達和純化,得到高純度的rbLBP蛋白和rbM-LBP蛋白。
2. 奶牛乳腺上皮細胞的優(yōu)化培養(yǎng)及其炎癥反應模型的建立選擇健康中國荷斯坦牛,無菌采集乳腺組織,采用組織塊接種法在DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)牛乳腺上皮細胞。細胞純化后分別用β-酪蛋白和角蛋白鑒定。
結果表明,奶牛乳腺上皮細胞純度在95%以上,符合試驗要求。LPS作用于牛乳腺上皮細胞12h,10、20、100μg/mL濃度的LPS處理組IL-1β、TNF-α表達及分泌均顯著上升,濃度在1～10Oμg/mL范圍內LPS作用有劑量依賴性,100μg/mL LPS處理組可能因細胞毒性的作用,IL-1β、TNF-α的表達有略微下降,但仍然顯著高于對照組（P<0.05）。
參考文獻
[1]Lipopolysaccharide-binding protein as a major plasma protein responsible for endotoxemic shock.P Gallay,D Heumann,D Le Roy,C Barras,M P Glauser.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.1993
[2]Staphylococcus aureus and Escherichia coli elicit different innate immune responses from bovine mammary epithelial cells.Fu Y,Zhou E,Liu Z,et al.Veterinary Immunology and Immunopathology.2013
[3]NF-κB:A pleiotropic mediator of inducible and tissue-specific gene control.Michael J.Lenardo,David Baltimore.Cell.1989
[4]Differential production of cytokines,reactive oxygen and nitrogen by bovine macrophages and dendritic cells stimulated with Toll-like receptor agonists.Werling Dirk,Hope Jayne C,Howard Chris J,Jungi Thomas W.Immunology.2003
[5]孫宇.重組牛脂多糖結合蛋白對脂多糖誘導奶牛乳腺上皮細胞炎癥反應的影響及其機制研究[D].南京農業(yè)大學,2015.