3752-25-8

103616-89-3

以2-氯肉桂酸為原料合成L-2-氯苯丙氨酸的一般步驟如下：首先，根據(jù)Rhodosporidium toruloides ATCC 10788的苯丙氨酸氨基裂解酶（PAL）蛋白質(zhì)序列（NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫編號CAA31209），由Genscript Corporation合成R. glutinis的PAL基因，并進(jìn)行密碼子優(yōu)化以適應(yīng)大腸桿菌表達(dá)。合成的PAL基因通過Genscript連接到pUC57載體的SmaI位點(diǎn)，構(gòu)建成pUC57_PAL質(zhì)粒。將5μg凍干的pUC57_PAL質(zhì)粒溶解于50μl MilliQ水中，取1μl溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，按照供應(yīng)商的協(xié)議進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在含有100μg/ml羧芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上于37℃過夜培養(yǎng)。挑選單一菌落接種于20ml含100μg/ml羧芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，制備8%甘油的菌液并保存于-80℃。將含有pUC57_PAL的DH5α菌株接種于1000ml含100μg/ml羧芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，28℃過夜培養(yǎng)。隨后，將培養(yǎng)物接種于10升TB培養(yǎng)基（含0.1g/l羧芐青霉素和1mM IPTG）中，37℃攪拌發(fā)酵9.5小時，轉(zhuǎn)速500至1500rpm。通過離心收集細(xì)胞，獲得230g濕細(xì)胞，分裝成10g等分試樣儲存于-20℃。反應(yīng)前，將適量細(xì)胞解凍并重懸于冷水中。將1.8g（10mmol）3-(2-氯苯基)-丙烯酸溶于0.5L 13vol%氨水溶液中，用25w/w% H2SO4調(diào)節(jié)pH至11。將130g濕細(xì)胞重懸于0.2L pH11的13vol%氨水溶液中，與底物溶液混合，總體積調(diào)節(jié)至1L。反應(yīng)在30℃、200rpm的密閉容器中進(jìn)行。初始1小時內(nèi)，每5分鐘加入0.91g（5.0mmol）3-(2-氯苯基)-丙烯酸，隨后7小時內(nèi)每25分鐘加入相同量。8.5小時后，離心去除細(xì)胞，HPLC測定反應(yīng)產(chǎn)率約91%，得到約18.1g（91mmol）2-氯苯丙氨酸。上清液（850mL，pH10.8）減壓濃縮（150至10mbar，60℃），去除約65%水后形成沉淀（pH7.5）。過濾沉淀，水洗去除無機(jī)鹽，干燥得14.9g產(chǎn)物，其中含57w/w% N-氨基-3-(2-氯苯基)-丙酸（8.5g，47%產(chǎn)率），24w/w%水和1.7w/w% 3-(2-氯苯基)-丙烯酸。(S)-2-氨基-3-(2-氯苯基)-丙酸的對映體過量（e.e.）為99%。母液中剩余9.5g (S)-2-氨基-3-(2-氯苯基)-丙酸。

參考文獻(xiàn)：

[1] Patent: EP1676838, 2006, A1. Location in patent: Page/Page column 17-18

[2] Patent: WO2006/69799, 2006, A1. Location in patent: Page/Page column 30-31

[3] Journal of the American Chemical Society, 2015, vol. 137, # 40, p. 12977 - 12983

[4] Catalysis Science and Technology, 2016, vol. 6, # 12, p. 4086 - 4089