活性氧檢測試劑盒(DHE熒光探針法)

中文名稱：活性氧檢測試劑盒(DHE熒光探針法)

英文名稱：ROS detection kit(DHE probe)

產(chǎn)品規(guī)格：200T

本試劑盒是一種利用熒光探針DHE(Dihydroethidium)進行活性氧檢測的試劑盒?？梢杂糜诟鞣N真核培養(yǎng)細胞、培養(yǎng)或灌流組織及組織冰凍切片的檢測，提供了活性氧陽性對照試劑，以便于活性氧的檢測。

DHE可自由透過活細胞膜進入細胞內(nèi)，并被細胞內(nèi)的ROS氧化，形成氧化乙啶；氧化乙啶可摻入染色體DNA中，產(chǎn)生紅色熒光。根據(jù)活細胞中紅色熒光的產(chǎn)生，可以判斷細胞ROS含量的多少和變化。二氫乙啶在細胞內(nèi)主要被超氧陰離子型ROS氧化，用流式細胞儀或熒光顯微鏡可直接觀察，是一種快速簡便的組織或培養(yǎng)活細胞中ROS經(jīng)典檢測方法。在激發(fā)波長535nm，發(fā)射波長610nm附近，使用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、熒光分光光度計、熒光酶標儀、流式細胞儀等檢測熒光，從而測定細胞內(nèi)活性氧水平。

活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括超氧自由基、過氧化氫、及其下游產(chǎn)物過氧化物和羥化物等，參與細胞生長增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過程。

產(chǎn)品特點：
· 使用方便：可用激光共聚焦顯微鏡直接觀察、熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測；
· 背景低，靈敏度高；
· 線性范圍寬，使用方便。

試劑盒組成：

保存條件：-20℃避光，有效期6個月

自備試劑和儀器：
· 培養(yǎng)基
· 移液器及吸頭
· 離心機
· 激光共聚焦顯微鏡或熒光分光光度計或酶標儀或流式細胞儀，激發(fā)波長535nm，發(fā)射波長610nm。

使用注意事項：
1．螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體收集至管底，避免開蓋時液體灑落。
2．熒光探針標記后，一定要洗凈殘余的未進入細胞內(nèi)的探針，否則會導(dǎo)致背景較高。
3．探針標記完畢并洗凈殘余探針后，可以進行激發(fā)波長的掃描和發(fā)射波長的掃描，以確認探針的標記情況是否正常。
4．盡量縮短探針標記后到測定所用的時間，以減少各種可能的誤差。
5．對于藥物作用時間較短(2小時以內(nèi))的細胞，先標記探針，后用藥物刺激細胞。對于藥物作用時間較長(6小時以上)的細胞，先用活性氧陽性對照誘導(dǎo)劑或相應(yīng)的藥物刺激細胞，后標記探針。
6．陽性對照誘導(dǎo)劑可以按照1:1000 的比例使用。例如標記好探針的細胞共1ml，可以加入1μl的陽性對照誘導(dǎo)劑刺激。通常刺激后20-30 分鐘內(nèi)可以觀察到非常顯著的活性氧水平升高。對于不同的細胞，活性氧陽性對照的效果可能有較大的差別。如果在刺激后30 分鐘內(nèi)觀察不到活性氧的升高，可以適當提高活性氧陽性對照誘導(dǎo)劑的濃度。如果活性氧升高得過快，可以適當降低活性氧陽性對照誘導(dǎo)劑的濃度。
7．DHE在光照和空氣中易被氧化，注意避光密封保存。
8．對不同的細胞和組織，應(yīng)選擇合適的孵育時間和濃度，以觀察ROS的變化。

使用方法：

DHE探針標記：
1．DHE 溶液可在新鮮培養(yǎng)液、緩沖鹽溶液或組織灌流液中稀釋到所需濃度，100～1000倍稀釋，以此染色液更換細胞培養(yǎng)液或灌流液；也可直接向細胞孵育液體或灌流液中加入DHE探針溶液至所需濃度。
2．依據(jù)細胞ROS含量的不同，DHE 終濃度可選擇在100-1000倍稀釋的范圍，孵育時間可選擇10～90分鐘，在37℃或室溫進行避光孵育。
3．孵育結(jié)束后，用新鮮溶液清洗細胞或組織。

熒光顯微鏡檢測：
1．對貼壁生長細胞或活組織，可直接在熒光顯微鏡下觀察；對懸浮生長細胞，取25～50μl細胞懸液滴到一張顯微載玻片上，再蓋上一張蓋玻片。
2．熒光顯微鏡下，用藍光或綠光激發(fā)，觀察和拍攝細胞紅色發(fā)射圖像，ROS陽性細胞在整個核區(qū)被染成紅色；用紫外光激發(fā)時，胞漿中未氧化的二氫乙啶可發(fā)出藍色熒光。

流式細胞儀分析：
1．對貼壁生長細胞，用胰酶消化制備成單細胞懸液；對懸浮生長細胞，直接收集細胞。用0.5～1 ml 冰冷PBS 重懸細胞（5～10萬）。
2．采用480～535nm 波長激發(fā)，測定590nm～610nm 以上的發(fā)射，細胞應(yīng)可分成兩個亞群：ROS陰性細胞僅有很低的熒光強度，ROS陽性細胞有較強的紅色熒光。

特別提示：本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！