pCMV-GFP-p62

pCMV-GFP-p62是信裕生物自行研發(fā)的在哺乳動物細胞中表達GFP標簽的人源p62融合蛋白的質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有CMV啟動子，為卡那霉素抗性，轉(zhuǎn)染細胞后能夠在靶細胞中高效表達綠色熒光蛋白GFP標簽的p62融合蛋白，呈現(xiàn)明亮的綠色熒光，可以用于細胞自噬(autophagy)的研究。本質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后，可以使用G418篩選穩(wěn)定表達融合蛋白的細胞株。
p62也稱sequestosome I (SQSTM1)，在多細胞生物(不包括植物和真菌)中高度保守，主要分布于細胞質(zhì)，也可以定位于細胞核、自噬體(autophagosome)和溶酶體(lysosome)中。p62是一種應激誘導的蛋白，可以作為信號樞紐(signaling hub)在氨基酸感應(amino acid sensing)和氧化應激等許多細胞事件中發(fā)揮重要作用，并且還可以作為PKC、ERK1、mTORC1、NF-кB和caspase-8等的支架蛋白(scaffold protein)而參與相應的信號轉(zhuǎn)導。p62全長440個氨基酸，包含一個PB1(Phox1/Bem1p)結(jié)構(gòu)域，一個鋅指結(jié)構(gòu)域(ZZ)，兩個核定位信號(NLS1和NLS2)，一個TB (TRAF6 binding)結(jié)構(gòu)域，一個LIR結(jié)構(gòu)域(LC3-interacting region)，一個KIR結(jié)構(gòu)域(Keap1-interacting region)，和一個C端的UBA(Ubiquitin-associated)結(jié)構(gòu)域。N端的PB1結(jié)構(gòu)域負責p62寡聚化以及與其它含PB1結(jié)構(gòu)域的蛋白相互作用。UBA結(jié)構(gòu)域?qū)τ诠丫刍膒62形成蛋白聚集體是必須的，特別是當細胞暴露于氧化環(huán)境中，其作為信號組織中心負責招募泛素化修飾的蛋白底物。作為支架蛋白，p62通過其UBA結(jié)構(gòu)域與蛋白聚集體(protein aggregate)相結(jié)合并將其導向自噬體從而將其降解。LIR結(jié)構(gòu)域含有一個富含酸性氨基酸和疏水氨基酸的簇(DDD和WxxL)，該酸性簇和LIR結(jié)構(gòu)域的其它兩個關(guān)鍵氨基酸Trp338/Leu341可與LC3蛋白中的多個位點 (N端的堿性氨基酸以及LC3的ubiquitin fold表面的兩個疏水口袋)相互作用。LIR結(jié)構(gòu)域與Atg8/LC3的相互作用負責引導泛素化的蛋白到蛋白酶體(proteasome)或自噬體中降解。p62與LC3的熒光共定位和在免疫共沉淀實驗過程中被一起沉淀(pull down)，說明它們參與了自噬過程中同一蛋白復合物的形成。在自噬起始的時候，p62與蛋白聚集體的復合物與LC3在自噬體的表面相結(jié)合，進而起始了蛋白聚集體的降解過程。p62與LC3蛋白的相互作用對于p62自身的自噬降解也是必須的，抑制自噬將導致p62的大量堆積，然后形成p62和泛素染色陽性的聚集體。Caspase-8被報道與p62相互作用，從而起始非死亡受體依賴的細胞凋亡信號通路。p62的功能異常與人類的多種疾病緊密相關(guān)，在肝功能紊亂，腫瘤和多種神經(jīng)退行性疾病的病人樣品中發(fā)現(xiàn)了異常堆積的p62聚集體。p62是蛋白聚集物(protein aggregates)中的常見組分，例如帕金森氏病(Parkinson disease)中的Lewy body，艾滋海默病(Alzheimer's disease)的神經(jīng)纖維纏節(jié)(neurofibrillary tangles)，Huntingtin disease病人的huntingtin aggregates中均含有p62。在佩吉特氏骨病(Paget's disease of bone)，肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥 (amyotrophic lateral sclerosis)以及額顳葉變性(frontotemporal lobar degeneration)等疾病中都有p62的突變被報道。
自噬(Autophagy)是一種在進化上高度保守的通過溶酶體吞噬并降解部分自身組分的細胞內(nèi)分解代謝途徑。自噬與多種生理功能有關(guān)，在饑餓等不利的環(huán)境條件下，細胞通過自噬降解多余或異常的細胞內(nèi)組分，為細胞的生存提供能量及原材料，促進生物體的生長發(fā)育、細胞分化及對環(huán)境變化產(chǎn)生應答。自噬異常與多種病理過程如腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、代謝疾病、病原體感染等都有密切關(guān)系。由于細胞自噬在生理和病理過程中都有重要作用，自噬已經(jīng)成為細胞生物學領(lǐng)域的一個新的研究熱點。
在用pCMV-GFP-p62轉(zhuǎn)染細胞后，熒光顯微鏡下GFP-p62通常以綠色點狀 (puncta)或較為彌散的斑塊狀(speckles)熒光存在于細胞質(zhì)和細胞核中。在自噬被抑制的情況下，這種綠色的點狀或斑塊狀物其大小會變大而且數(shù)目會變多。p62的熒光標記對于自噬的誘導、自噬的抑制以及蛋白聚集體的清除都是一個非常好的研究工具。
pCMV-GFP-p62質(zhì)粒的主要信息如下：

pCMV-GFP-p62質(zhì)粒(6349bp)的圖譜如下：

pCMV-GFP-p62表達基因的詳細圖譜如下：

pCMV-GFP-p62中沒有的酶切位點(Restriction enzymes that do not cut pCMV-GFP-p62)包括：

pCMV-GFP-p62中的單酶切位點(Restriction enzymes that cut pCMV-GFP-p62 once)包括：

pCMV-GFP-p62質(zhì)粒中推薦使用的測序引物序列如下：
T3 primer(620-639): 5´-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3´
T7 primer (2851-2872): 5´-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3´
pCMV-GFP-p62的全序列信息請參考信裕生物網(wǎng)站上該質(zhì)粒的信息。
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