PCR Kit with BeyoTaq
本PCR試劑盒帶有BeyoTaq DNA Polymerase、PCR buffer、dNTP和上樣緩沖液，自備模板和引物即可進(jìn)行PCR反應(yīng)，適合用于各種常規(guī)PCR以及T載體克隆、點(diǎn)突變等，能在高效擴(kuò)增DNA模板的情況下同時(shí)保證高保真性。
BeyoTaq DNA Polymerase簡(jiǎn)稱BeyoTaq酶，是一種兼顧了高保真性和高擴(kuò)增效率的DNA聚合酶。
BeyoTaq酶可以催化5’至3’方向的依賴于DNA模板的脫氧核苷酸的聚合。同時(shí)BeyoTaq酶有3’至5’的外切酶活性(proofreading activity)。另外，BeyoTaq酶有5’至3’外切酶活性，但BeyoTaq酶沒有反轉(zhuǎn)錄酶活性。
由于BeyoTaq酶有3’至5’的外切酶活性，因此在PCR擴(kuò)增過程中出錯(cuò)的幾率大大降低，出錯(cuò)率為1.6×10-6-6 per nt per cycle，略低于Pfu酶的2.6×10-6 per nt per cycle。
BeyoTaq酶的DNA擴(kuò)增效率大大高于Pfu酶，和Taq酶的擴(kuò)增效率比較接近，很好地兼顧了擴(kuò)增效率和擴(kuò)增的準(zhǔn)確性。
用途：高保真PCR (high fidelity PCR)、點(diǎn)突變、T載體克隆等各種常規(guī)PCR反應(yīng)。
用BeyoTaq酶擴(kuò)增產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物帶有3’-dA overhangs，可以用于基于T載體的PCR片段克隆。
BeyoTaq酶可以擴(kuò)增長(zhǎng)度達(dá)5kb的DNA片段，最長(zhǎng)可以擴(kuò)增長(zhǎng)達(dá)10kb的DNA片段。通常適合擴(kuò)增3kb以下的DNA片段。
活性定義：One unit of the enzyme catalyzes the incorporation of 10 nmol of deoxyribonucleotides into
a polynucleotide fraction (adsorbed on DE-81) in 30 min at 72℃. Enzyme activity is assayed in the following mixture: 20 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25℃), 2 mM MgSO4, 10 mM (NH4)2SO4, 10 mM KCl, 0.1% (v/v) Triton X-100, 0.1 mg/ml BSA, 0.75 mM activated calf thymus DNA, 0.2 mM of each dNTP, 0.4 MBq/ml [3H]-dTTP.
純度：不含DNA內(nèi)切酶、外切酶和磷酸酯酶，不含RNA酶，滿足常規(guī)PCR反應(yīng)要求。
酶儲(chǔ)存溶液：20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 100 mM KCl, 0.1% (v/v) Nonidet P40, 0.1% (v/v)
Tween 20 and 50% (v/v)glycerol。
10X BeyoTaq Buffer (with Mg2+)：200 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25℃), 100 mM (NH4)2SO4, 100 mM KCl, 20mM
MgSO4, 1% (v/v) Triton X-100, 1 mg/ml BSA。
失活或抑制：酚氯仿抽提可以使BeyoTaq酶失活。
試劑盒帶有dNTP，該dNTP為dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合物，每種的濃度均為2.5mM。
本試劑盒用于50微升的PCR反應(yīng)體系，足夠用于160個(gè)反應(yīng)，用于20微升的PCR反應(yīng)體系，足夠用于400個(gè)反應(yīng)。
包裝清單：
產(chǎn)品編號(hào)
產(chǎn)品名稱
包裝
XY-7237-1
BeyoTaq DNA Polymerase (5U/μl)
200U
XY-7237-2
10X BeyoTaq Buffer (with Mg2+)
1ml
XY-7237-3
dNTP (2.5mM each)
0.7ml
XY-7237-4
6X DNA Loading Buffer
1ml×2
保存條件：
-20℃保存。
注意事項(xiàng)：
由于PCR反應(yīng)非常靈敏可以擴(kuò)增目的基因序列超過1000萬倍，在使用BeyoTaq酶時(shí)請(qǐng)注意避免微量待擴(kuò)增DNA的污染，并盡量考慮設(shè)置不加模板的空白對(duì)照以確認(rèn)是否有待擴(kuò)增DNA的污染。
BeyoTaq酶有3’至5’的外切酶活性，無dNTP時(shí)可以降解引物。因此BeyoTaq酶一定要最后加入，并且要在冰浴上操作。
不能使用Taq酶的PCR Buffer來替代Pfu酶的PCR Buffer。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用說明：
- 1.PCR反應(yīng)體系的設(shè)置：
- a.溶解并混勻PCR反應(yīng)所需的各種溶液。將BeyoTaq DNA Polymerase置于冰浴上或冰盒內(nèi)。
- b.參考下表在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)(如果有多個(gè)類似的PCR反應(yīng)，可以先配制大體積的包含水、buffer、dNTP和BeyoTaq酶的混合物，然后分裝到各PCR反應(yīng)管內(nèi)。根據(jù)情況，有時(shí)混合物中可以包括引物)：
雙蒸水或Milli-Q水
-
(36.75-x)μl
(14.7-y)μl
10X BeyoTaq Buffer (with Mg2+)
1X
5μl
2μl
dNTP (2.5mM each)
0.2mM each
4μl
1.6μl
引物混合物(10μM each)
0.8μM
4μl
1.6μl
BeyoTaq DNA Polymerase (5U/μl)
1.25U/50μl
0.25μl
0.1μl
- *對(duì)于不同類型的模板在50μl反應(yīng)體積中推薦用量如下：哺乳動(dòng)物基因組DNA：0.1-1μg；大腸桿菌基因組DNA：10-100ng；質(zhì)粒DNA：0.1-10ng。過多的模板DNA容易導(dǎo)致非特異性的PCR產(chǎn)物。
- c.用移液器輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫離心數(shù)秒，使液體積聚于管底。
- d.如果所使用的PCR儀有熱蓋則省略本步驟。如果PCR儀沒有熱蓋，則在管內(nèi)滴入一滴礦物油(mineral oil，ST275)。
- e.各設(shè)置好的PCR反應(yīng)管置于PCR儀上，開始PCR反應(yīng)。
- 2.PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置可以參考如下示例：
- STEP1(起始變性): 94℃ 3min
- STEP2(變性): 94℃ 30sec
- STEP3(退火): 55℃ 30sec
- STEP4(延伸): 72℃ 2min
- STEP5(循環(huán)): Go To STEP2 for 30 cycles
- STEP6(最終延伸): 72℃ 10min
- STEP7(臨時(shí)保存): 4℃ forever
- a.PCR反應(yīng)的設(shè)置需根據(jù)模板、引物、PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度和GC含量等條件的不同設(shè)定不同的PCR反應(yīng)條件包括溫度、時(shí)間和循環(huán)數(shù)等。
- b.STEP4(延伸)的時(shí)間設(shè)置需根據(jù)PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度進(jìn)行設(shè)置，通常每kb產(chǎn)物的延伸時(shí)間為1.5分鐘。例如PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度為1kb，則延伸時(shí)間可以設(shè)置為1.5分鐘，PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度為2kb，則延伸時(shí)間可以設(shè)置為3分鐘，以此類推。
- c.對(duì)于初次進(jìn)行的PCR，為盡量確保可以擴(kuò)增出預(yù)期的PCR產(chǎn)物，可以把循環(huán)數(shù)設(shè)置為35。對(duì)于需進(jìn)行半定量或定量的PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)一定要進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化，使PCR反應(yīng)沒有達(dá)到平臺(tái)期。
常見問題：
- 1.PCR產(chǎn)物非常少或沒有特異性條帶。
- a.引物設(shè)計(jì)不佳是PCR過程中最常見的問題。請(qǐng)選擇適當(dāng)?shù)囊镌O(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，注意引物的GC含量、二級(jí)結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長(zhǎng)度、特異性等方面的問題。在加入酶切位點(diǎn)等的引物中，一定要注意加入酶切位點(diǎn)等后整條引物的GC含量、二級(jí)結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長(zhǎng)度、特異性等方面的問題。在原有引物效果不佳的情況并且陽性對(duì)照引物可以正常工作的情況下，可以考慮更換引物。
- b.待擴(kuò)增片段GC含量偏高。GC含量較高的情況下PCR會(huì)變得相對(duì)比較困難，此時(shí)可以使用適合擴(kuò)增高GC含量DNA片段的GC-rich buffer，并相應(yīng)地根據(jù)GC-rich buffer的要求或說明調(diào)整PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置。
- c.超長(zhǎng)片段擴(kuò)增。盡管BeyoTaq DNA polymerase可以擴(kuò)增較長(zhǎng)的DNA片段，但大多數(shù)時(shí)候比較適合擴(kuò)增10kb以下的片段，更長(zhǎng)片段的擴(kuò)增推薦使用其它更適合長(zhǎng)片段擴(kuò)增的DNA聚合酶。
- d.PCR反應(yīng)設(shè)置時(shí)在室溫進(jìn)行容易導(dǎo)致非特異性條件。推薦在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)。
- e.由于引物存在一定的二級(jí)結(jié)構(gòu)或存在一定的引物二聚體，或引物偏短，導(dǎo)致退火效果不佳。此時(shí)可以采用Touch down等方法進(jìn)行退火，通常采用從65℃逐步緩慢降溫到55℃或50℃的方法，使退火更加充分。
- f.退火溫度不佳，需要優(yōu)化。如果有溫度梯度PCR儀，則可以設(shè)置退火的溫度梯度，摸索退火的溫度。如果沒有溫度梯度PCR儀，則可以通過多次PCR反應(yīng)摸索的退火溫度。
- g.延伸時(shí)間不足?？砂凑彰?kb片段延伸2分鐘進(jìn)行設(shè)置，對(duì)于較難擴(kuò)增的片段可以設(shè)置為每1kb片段延伸3分鐘。
- h.待擴(kuò)增片段GC含量較高或長(zhǎng)度較長(zhǎng)，變性不夠充分。可以調(diào)節(jié)起始變性條件至95℃ 1min甚至95℃ 2-4min。
- i.在不同PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，避免有時(shí)PCR儀出現(xiàn)問題。
- j.循環(huán)數(shù)不足，適當(dāng)延長(zhǎng)PCR的循環(huán)數(shù)。通常循環(huán)數(shù)最高不必超過40，常用的循環(huán)數(shù)范圍為25-35。
- k.模板含量太低，適當(dāng)加大模板量，或采用巢式PCR(nested PCR)或二次PCR。巢式PCR即為在原先設(shè)計(jì)的PCR引物內(nèi)側(cè)再設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，然后對(duì)次PCR產(chǎn)物進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，這樣一方面可以起到擴(kuò)增作用，同時(shí)也可以從次PCR產(chǎn)物中擴(kuò)增出特異性條帶。二次PCR則為比較簡(jiǎn)單地用原有引物對(duì)次PCR產(chǎn)物進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，可以起到擴(kuò)增作用，但不能去除非特異性條帶。
- l.模板中含有抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)，可以用適當(dāng)?shù)腄NA純化方法例如柱純化等純化模板DNA。
- m.當(dāng)產(chǎn)生較多非特異性條帶時(shí)，可以適當(dāng)提高退火溫度。
- n.注意設(shè)置適當(dāng)?shù)年栃詫?duì)照和陰性對(duì)照通常會(huì)有很大幫助。
關(guān)鍵字： PCR Kit with BeyoTaq說明書；PCR Kit with BeyoTaq
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