包涵體微量純化試劑盒
產(chǎn)品及特點包涵體（Inclusion Body）是指超表達(dá)的蛋白在細(xì)胞胞漿內(nèi)（如果超表達(dá)的是胞漿蛋白）或膜間內(nèi)（如果超表達(dá)的是分泌蛋白）凝集形成的無活性的固體顆粒。包涵體形成的主要原因是在重組蛋白的表達(dá)過程中缺乏某些蛋白折疊輔助因子，或環(huán)境不適導(dǎo)致無法形成正確的蛋白質(zhì)次級鍵。由于包涵體主要由超表達(dá)的重組蛋白質(zhì)組成，因此分離純化包涵體是分離純化具有活性的重組蛋白的步。本產(chǎn)品就是用于快速的提取高質(zhì)量的包涵體。它具有下列特點：

1. 操作簡單快速，整個過程只要三十分鐘左右。

2. 微量純化，可以在 1.5mL 離心管中完成。

3. 能有效去除包涵體中的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜等非重組蛋白成份，使重組蛋白所占比重達(dá)到 60%以上。

4. A 型用于超聲法裂菌，B 型用于酶法裂菌。

5. 可以選擇鹽酸胍和尿素兩種蛋白溶解方式。

6. 得到的包涵體溶解液可以用于重折疊、SDS-PAGE 或其他純化處理。
包涵體微量純化試劑盒
規(guī)格及成分 成 份 編 號 小扁盒包裝
包涵體純化溶液 A 90508a 5 mL
包涵體純化溶液 B 90508b 50 mL
包涵體溶解液 90508c 5 mL
尿素（干粉） 100873 5g 干粉
溶菌酶（干粉） 100406 600 mg（低溫成分）
Benzonase 溶液（1U/uL） 101001 20 uL（低溫成分）
使用手冊 90508sc 1 份

包涵體微量純化試劑盒運輸及保存 常溫運輸和保存、溶菌酶和 Benzonase 需要低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。

自備試劑 無

使用方法 一：超聲法裂菌

1. 在蛋白誘導(dǎo)期結(jié)束時，轉(zhuǎn)移 1.5 mL 菌液到一個干凈的塑料離心管中。同時用

不加誘導(dǎo)物的細(xì)菌做平行對照實驗。

2. 12,000 rpm 室溫離心 1 分鐘，小心棄上清。沉淀（約 10 mg）放冰上待用或放-80℃

保存。

3. 加入 250 uL 冰浴的包涵體純化溶液 A，冰上超聲裂解菌體直到在顯微鏡下看見絕

大多數(shù)細(xì)胞破裂。超聲參數(shù)需根據(jù)儀器型號自行摸索，但裂解物必須不粘稠，否則

不容易沉淀包涵體。

4. 直接進(jìn)入第 14 步。

二：酶法裂菌

5. 一次微量提取需要 250 uL 包涵體純化溶液 A，用前取包涵體純化溶液 A，按每

mL 加入 120mg 溶菌酶的比例加入所需溶菌酶并搖晃溶解待用。溶菌酶的溶液非

常不穩(wěn)定，所以現(xiàn)配現(xiàn)用，沒用完的可以在-20℃放一周。

6. 包涵體中的重組蛋白一般比溶解狀態(tài)中的蛋白質(zhì)更能夠抵抗微量內(nèi)源性蛋白水解

酶的降解，但如果實驗發(fā)現(xiàn)得到的重組蛋白確有降解，則需要在包涵體純化溶液 A

中新鮮加入自備的蛋白酶抑制劑混合物（CAT#：80808）。

7. 在蛋白誘導(dǎo)期結(jié)束時，轉(zhuǎn)移 1.5 mL 菌液到一個干凈的塑料離心管中。同時用

不加誘導(dǎo)物的細(xì)菌做平行對照實驗。

8. 12,000 rpm 室溫離心 1 分鐘，小心棄上清。

9. 加入 250 uL 含溶菌酶的包涵體純化溶液 A 重懸細(xì)胞。

10. 室溫放置 20 分鐘裂解細(xì)菌，其間可以用手輕彈離心管混勻。

11. -20℃冷凍至凝固。注意：一定要凝固到細(xì)菌溶液變成固體為止。

12. 室溫水浴解凍。如果裂解充分，細(xì)菌釋放出的 DNA 將使裂解物十分粘稠。如果不

粘稠，說明裂解不充分，需要重復(fù)凍融步，否則完整細(xì)菌將和包涵體一起沉淀，影

響包涵體的純度。在顯微鏡下檢查細(xì)菌是否充分裂解。

13. 加入 1 uL Benzonase 溶液(1U/uL)，脫色搖床上搖晃直到裂解液不再粘稠，一般

需要 30 分鐘左右，否則還需要延長保溫時間。

14. 12,000 rpm 4℃離心 5 分鐘，留存上清作為 SDS-PAGE 的對照樣品一。

15. 將沉淀（包涵體）懸浮在 1 mL 的包涵體純化溶液 B 中，室溫放置 5 分鐘。

16. 12,000 rpm 4℃離心 10 分鐘，留存上清作為 SDS-PAGE 的對照樣品二。

17. 將沉淀（包涵體）懸浮在 1mL 的包涵體純化溶液 B 中，室溫放置 5 分鐘。

18. 12,000 rpm 4℃離心 10 分鐘，留存上清作為 SDS-PAGE 的對照樣品三。本產(chǎn)品

提供的包涵體純化溶液 B 足夠兩次洗滌（兩次洗滌一般可得到足夠純凈的包涵體）。

如果需要更多洗滌，用戶需要單獨購買包涵體洗滌液（溶液 B）。

19. 沉淀為純化的包涵體，可以長期放置在冰箱待用或直接用于包涵體溶解。

三：包涵體的溶解：

20. 在包涵體沉淀中加入 250 uL 包涵體溶解液，用槍頭充分吹打后漩渦震蕩室溫放置

1 小時使蛋白質(zhì)充分溶解。注意：包涵體溶解液含 6M 鹽酸胍，溶解蛋白能力強(qiáng)于

含 8M 尿素的溶解液，但 SDS-PAGE 時不能直接上樣?？蛻粢部梢杂帽驹噭┖刑?/p>

供的尿素干粉自配 8-10 M 尿素的溶液（尿素溶液不穩(wěn)定，所以不能長期放置）溶

解包涵體，得到的溶解液可以直接用于 SDS-PAGE 或后續(xù)純化。但其溶解能力弱

于鹽酸胍。

21. 20，000g 4℃離心 20 分鐘，小心收集上清，保留不溶性沉淀（未能溶解的包涵體）。

SDS-PAGE 檢查是否大部分重組蛋白都在上清中。如果沒有，說明包涵體沒有完

全溶解，需要用適當(dāng)增加包涵體溶解液的用量。

22. 所得蛋白質(zhì)溶液可以用于復(fù)性等試驗。用戶可本公司購買包涵體復(fù)性套裝。