【嘉美生物】成立于1896年的羅氏公司是以研究為導向的健康事業(yè)公司,總部位于瑞士巴塞爾。經過百年的歷程,羅氏在眾多領域已成為全球的領先者,比如說全球診斷領域排名;全球腫瘤領域排名;全球生物科技領域排名第二。羅氏公司應用科學部致力于生命科學領域產品的開發(fā), 1998年收購德國寶靈曼(Boehringer Mannheim)公司后,Roche的產品涵蓋了分子生物學,細胞學,免疫學,蛋白質組學,生物化學等多個研究領域。羅氏擁有PCR以及地高辛標記產品的全球專利,其DIG標記產品和細胞凋亡相關產品在業(yè)內享有極高的聲譽。
一、獨一無二的非脂質體型FuGENE 6
在轉染方面,Roche的王牌產品FuGENE 6同樣享有極佳的聲譽。這個早在上世紀90年代中期由寶靈曼研發(fā)的王牌產品歷時多年,依然是當今轉染領域用的產品之一。在2004年度產品評選活動中FuGENE 6當選2004年度最值得信賴試劑產品,一位投票人在推薦理由中這樣寫到:“從未令我失望過。”確實,我自己以前也曾經試過在同樣條件下用Clonfectin、Lipofectamine等幾個轉染試劑同時轉染實驗室里3種不同的細胞株,暫且不說實驗的復雜程度和轉染效率高低——單說這轉染后報告基因表達效果,鏡下檢查FuGENE轉染的細胞的綠色熒光都是最明亮,也是最多的。對于做表達的人來說,夫復何求?當然,這并不排除有細胞株的影響因素在內。
特點:
FuGENE 6是一種非脂質體型(non-liposomal)轉染試劑,由專利配方的脂質混合體(lipids)和特定成分組成,通過加入的創(chuàng)新性組分,在增加核酸穩(wěn)定性的同時,提高轉染試劑-DNA復合體穿越細胞膜的效率;而這一過程速度的提高,預示了將整個轉染過程對正常細胞生理功能的影響減到最小。這些是陽離子脂質轉染試劑所不能達到的。轉染試劑-DNA復合物可以直接加入細胞培養(yǎng)基中,有血清也不怕,而且轉染前后都不需要更換培養(yǎng)基,不用去除轉染試劑。FuGENE 6的細胞毒性很小,每一批產品出廠前都要經過嚴格質控,其中就包括在有血清存在且無需更換培養(yǎng)基的情況下, COS-1細胞與FuGENE6轉染液或FuGENE6-DNA復合體溫育26小時,PI染色后流式細胞儀分析細胞存活率必須在95%以上!
適用的細胞系范圍:
FuGENE 6的細胞毒性很小,可轉染細胞系范圍非常廣泛,到目前為止已經超過750多種,范圍之廣無人能及,其中還包括90多種原代細胞和部分不易轉染的細胞株/系。Roche的網站也做得十分貼心,如果你想查一下你手頭的細胞株是否在這成功轉染的列表中,可以訪問(http://www.roche-applied-science.com/sis/fugene/),不單可以檢索,還有詳細的列表和Reference——如果不在其中,你可以根據其他成功轉染的細胞信息來判斷自己的是否值得去嘗試。不管怎么說,FuGENE 6一般都可以滿足你的需求。
轉染核酸范圍和大小:
FuGENE 6轉染試劑不單可用于常規(guī)的DNA轉染,還可用于長達10kb的大片段DNA, 寡聚核苷酸及核苷酸的高效轉染,操作簡便,不需要特殊的優(yōu)化過程,大大減少試驗中的操作步驟,適用于高通量檢測方面的應用。但是,FuGENE 6 確乎不建議用在RNA或者siRNA轉染上,在RNAi風行的今天確實是個遺憾。要用FuGENE 6 做RNAi,你只好用siRNA表達質粒載體了。
操作流程:
FuGENE 6的操作也是非常簡便的(6孔板操作方案)
1、培養(yǎng)細胞計數鋪板在含血清,但不含抗生素的正常培養(yǎng)基中,到轉染當天50%—80%匯片。
2、FuGENE 6在室溫化凍后混勻后取3-6ul,用無血清培養(yǎng)基稀釋到100ul,混勻孵育5分鐘
3、按照轉染試劑:DNA(ug)比例3:1直接加入DNA,混勻并孵育15分鐘以上。(孵育較長的時間,比如30min-60min,有助于提高某些細胞株的轉染效率,但不超過2小時為宜)
4、逐滴加入培養(yǎng)細胞的6孔板中,培養(yǎng)細胞1-3天檢查結果。
由于操作步驟簡便,FuGENE 6 轉染方案很容易放大,也很適合進行高通量篩選。
用量和價格:
價格和包裝大小永遠是實驗室關注的重要因素。其實不單這個,每次的用量和成本,也就是一個包裝可用的次數也應該是我們所關注的。FuGENE 6的價格1ml298美元,大概¥3000出頭,千萬別以為很貴,FuGENE 6的用量很省的,同樣條件用量比別家少一大半以上--你要知道,按照6孔板轉染實驗來計算,每次只需要3-6ul,1ml FuGENE 6足夠做300次6孔板轉染!而其他有些主流品牌起碼要10-24ul/次6孔板 呢!這里要特別注意,FuGENE 6產品標注的可用轉染次數是以6孔板為標準的,而有些品牌是以24孔板為基礎,二者沒有可比性,因為6孔板每孔面積比24孔板大5倍,所以,千萬別以為1ml不如人家包裝大啦,其實每次的成本是很節(jié)約的,能用的次數其實還要更多呢!在進口產品中這個價格相當實惠的!濃縮才是精華,再加上FuGENE 6的良好性能,這么多年來依然笑傲江湖,自然有它的道理。
注意事項:
FuGENE 6要求的轉染時鋪板密度在50%-80%間。由于轉染試劑保存在80%乙醇中,FuGENE 6平時應該保存在-20度,在4度條件下可以只能穩(wěn)定3周而不影響活性。由于有乙醇保護,反復化凍開蓋不會導致氧化所以不影響活性,所以不要分裝FuGENE 6!不均勻的黏附到新的管壁上反而影響試劑穩(wěn)定!另外要注意使用前必須完全化凍到室溫,并且要振蕩1秒以充分混勻才可以取樣稀釋。稀釋時要特別注意將tips插入無血清培養(yǎng)基中迅速吹打混勻,不要靠壁或者只在液面吹打,防止脂質成分平鋪在培養(yǎng)基表面而影響復合物形成。千萬不要先加轉染試劑再加無血清培養(yǎng)基稀釋,切記。FuGENE 6 很怕某些塑料表面的(只有Tips和原裝管子那種塑料安全),可能里面的脂質會有反應吧。
同樣的,稀釋用培養(yǎng)基必須是無血清培養(yǎng)基,從而保證轉染試劑-DNA復合物形成。由于轉染試劑可能會將抗生素帶入細胞或者增加細胞通透性而影響細胞存活率,所以要求用不添加抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞,即使要用抗生素篩選,也要至少培養(yǎng)足夠的時間讓抗性基因表達后再換篩選培養(yǎng)基。細胞培養(yǎng)時血清的存在不影響轉染效果,甚至,實驗表明在有血清的培養(yǎng)基中轉染而且不更換培養(yǎng)基,轉化效率還好一點點。
DNA的低內毒素的,因為某些細胞株對內毒素敏感。精確定量DNA,保證轉染試劑(ul)和DNA(ug)比例3:1。Carrier DNA可免則免,如果非要加不可,那就多加些轉染試劑,保證3:1的總DNA量。反正FuGENE 6 毒性小,多加些也不會毒死細胞的。某些細胞株如果表達不好或者轉染效率不高還可以試試同時按比例增加轉染試劑和DNA的量,往往有幫助。
二、一個強過一個的D家兩姐妹
DOTAP和DOSPER可算得上是久經考驗的古董級的老產品了,操作簡便,“內外兼修”的DOTAP作為單價陽離子脂質體轉染試劑,主要特點是轉染效率高,對細胞毒性小。DOTAP可以吸附帶負電荷的DNA、 RNA、寡核苷酸、核蛋白以及其他的大分子轉染到真核細胞中,對大多數細胞株的轉染效率普遍要比傳統(tǒng)的磷酸鈣和DETA-葡聚糖的方法高5-100倍,而且,DOTAP除了可以進行體外操作外,還可以進行體內操作,因此目前已經被廣泛應用于在非人類的動物模型基礎上的基因治療的研究中。此外,決定選擇DOTAP的實驗室人員還有一個原因,那就是DOTAP可以在混合物中有或沒有血清的情況高效轉染,這為一些需要血清“保護”的細胞株的轉染提供了方便。
DOTAP轉染試劑固然好用,但是它的“妹妹”DOSPER轉染試劑的設計更為巧妙。DOSPER試劑是經改進的多價陽離子脂質體轉染試劑(polycationic lipid)。與DOTAP 不同,DOSPER的脂肪酸連接到了丙烷骨架的1、3位,這一特殊的結構可以使得DOSPER可以在較低的濃度下發(fā)揮作用 (DOTAP所需比例為5—10ug /ug DNA,DOSPER為2—10ug/ug DNA),從而減小對細胞本身的損傷,帶來更好的轉染試驗結果,適用于某些不易轉染的細胞株??芍^一半用量,雙倍效果。
三、各有專攻的X兄弟
RNA干擾技術已經成為了研究基因功能的有力工具,任何一個RNA interference實驗的成功都有賴于轉染試劑的選擇,沒有高效的轉染,siRNA就不能有效的引發(fā)相應的細胞響應,會直接影響同一siRNA的抑制效果。為了彌補FuGENE 6 不能轉染siRNA的遺憾,近期羅氏推出了X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent,這種轉染試劑專門針對siRNA的轉染(包括siRNA直接疽約皊iRNA和表達質粒共同轉染),比較于同類產品來說,主要優(yōu)勢一是有效的基因敲除(gene knockdown)效果(見下圖),其次是其兼容性,因為X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent可以用于siRNA直接轉染以及siRNA和表達質粒共同轉染。第三就是它可以高效轉染常見的哺乳動物的細胞株及部分不易轉染的細胞株,而且對細胞的毒性和物理破損低,X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent操作簡便,反應前后無需更換介質。siRNA專用的轉染產品經過專門優(yōu)化,應該優(yōu)于多功能轉染試劑,而且產品具有很高的性價比,每個反應僅需要約0.40美金(1ml可做400次24孔板)。
除此之外,羅氏也提供了一種X-tremeGENE siRNA Dicer Kit,進一步方便了siRNA轉染,這一試劑盒模擬了細胞RNAi的途徑--利用Dicer RNase將雙鏈RNAs加工成小的21—24bp的小分子雙鏈RNA斷片段,體外生成d-siRNA,這樣就可以在短時間內準備好更有效的siRNA用于轉染。
> 90 % knockdown
70 - 90 % knockdown
60 - 70 % knockdown
“術業(yè)有專攻”的X-tremeGENE Q2轉染試劑則是專門針對Hela, K-562和Jurkat細胞而優(yōu)化設計的,可以有效提高轉染后蛋白表達,適用于在這幾類細胞中大量蛋白表達研究。
產品信息:
Roche
4709691001
FuGENE HD Transfection Reagent
0.4 ml (up to 120 transfections)
2098
Roche
4709705001
FuGENE HD Transfection Reagent
1.0 ml (up to 300 transfections)
4851
Roche
4709713001
FuGENE HD Trans Rgt Mega-pack
5 x 1 ml (up to 1,500 transfections)
23486
Roche
5061369001
FuGENE HD Transfection Reagent
10 ml
46954
Roche
11814443001
FuGENE 6 Transfection Reagent
1ml(300 transfections)
3545
Roche
11988387001
FuGENE 6 Transfection Reagent
5 x 1 ml (1,500 transfections)
15935
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關鍵字:
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嘉美的產品和服務涵蓋生命科學研究技術的諸多方面,提供覆蓋分子