中文名：牛痘病毒加帽酶
英文名：Vaccinia Capping Enzyme
純度：醫(yī)藥級
貨號：V406454
包裝：500u
存儲溫度：-20°C儲存
產品介紹：
產品基本信息
來源：攜帶牛痘病毒加帽酶基因的E.coli
反應條件：1x Capping Buffer (50 mM Tnis-HC1, pH 8.0; 5 mM KC1; 1 mMMgaly; 1 mM DTT). 37℃孵有
儲存緩沖液：20mM Tnis-HC1 pH8.0;100mMNaC1; 1mM DTT; 0.1mMEDIA;0.1%TritonX-100;50% (wv) Glycerol
產品描述
體外轉錄獲得的mRNA未經細胞內一系列修飾，不具備Cap 結構與PolyA 尾，容易降解，易激活免疫反應，不能與核糖體起始蛋白結合，無法啟動蛋白翻譯，因而在工業(yè)化mRNA生產中，需使用牛痘病毒加帽酶對IVT 的mRNA進行加帽修飾，使mRNA的5' 端獲得Cap0 結構，進一步使用2'-O- 甲基轉移酶將Cap0 轉化為Cap1。酶法加帽引入的帽結構與真核生物體內天然帽結構完全一致，從根本上降低外源mRNA 免疫原性的同時，保護其不被降解，并提高翻譯效率，增加細胞內蛋白產量。通過酶法加帽最大可獲得100%的加帽效率，而通過化學合成帽類似物結構加帽，其加帽效率相對較低，并且帽類似物結構與天然帽結構有差異。
牛痘病毒加帽酶將 7-甲基鳥苷帽結構（m7Gppp，Cap0）加到 RNA 的 5′ 末端。在真核生物中，該結構與 mRNA 的穩(wěn)定、轉運和翻譯密切相關。通過酶促反應為 RNA 加帽是一種簡單有效的方法，能顯著改善用于體外轉錄、轉染和顯微注射的RNA的穩(wěn)定性和翻譯能力。這種酶由兩個亞基（D1 和 D12）組成 （圖 1a），D1 亞基執(zhí)行 RNA 三磷酸酶和鳥苷轉移酶的功能，D12亞基執(zhí)行鳥嘌呤甲基轉移酶的功能，它們對于添加一個完整的 Cap0 結構 m7Gppp5′N 都是必須的（圖 1b）。?
本制品可用于 T7 RNA Polymerase, GMP Grade（GMP-E121，Novoprotein）反應產生的 RNA 的加帽反應，加帽反應在一小時之內完成，效率接近 100%，并且保證正確的方向。?
重組牛痘病毒加帽酶利用大腸桿菌大規(guī)模發(fā)酵表達，采用藥用規(guī)格原輔料生產，并嚴格控制宿主蛋白質殘留、核酸殘留等，符合 GMP 規(guī)范的產品生產與質量管理規(guī)程保障生產過程及所有原輔料可追溯。
圖1. 牛痘病毒加帽的結構和作用機理。a. 牛痘病毒加帽酶和 GTP（紅色）、SAH（玫紅）的共結晶結構 (PDB 4CKB) 。該酶由 D1 和 D12 兩個亞基組成，兼具 RNA 三磷酸酶（藍色）、鳥苷轉移酶（橙色）和鳥嘌呤甲基轉移酶（米黃色）的功能。本圖引自 Ramanathan, A., Robb, G. B., & Chan, S. H. (2016). mRNA capping: biological functions and applications. Nucleic Acids Res 44(16), 7511–7526. b. mRNA 的帽結構是由一個7-甲基鳥苷通過一個 5′–5′三磷酸酯橋連接到 mRNA 鏈的 5′核苷上組成。Cap-0 結構由相鄰的 RNA 鏈通過三種酶的依次反應形成。進一步形成 cap-1 結構需要 2-O 甲基轉移酶的參與，該修飾可以降低RNA 在體內引起的細胞先天免疫反應。本圖引自 Decroly, E., Ferron, F., Lescar, J. et al. (2012). Conventional and unconventional mechanisms for capping viral mRNA. Nat Rev Microbiol 10, 51–65。?
質量要求
| 項目 | 標準 | 方法 | | 外觀 | 澄明液體 | 目視檢查 | | 可見異物 | 符合規(guī)定 | 中國藥典2020版第四部第一法燈檢法(通則0904) | | pH值 | 7.5-8.5 | 中國藥典2020版第四部 pH值測定法(通則0631) | | 活性 | 9.8KU/ml-10.2KU/ml | 加帽修飾與效率測定法 | | 純度 | ≥95% | 中國藥典2020版第四部高效液相色譜法(通則 0512) | | 核酸內切酶殘留 | 004-DNA的降解不超過10% | 10U酶與004-DNA.37℃孵育3h | | 核酸外切酶殘留 | 019 Hind Ⅲ DNA 的降解不超過10% | 10U酶與019 Hind Ⅲ DNA.37℃孵育3h | | RNA酶殘留 | 293-RNA的降解不超過10% | 10U酶與293-RNA，37℃孵育1h | | 細菌內毒素含量 | ≤10 EUmg | 中國藥典2020版第四部凝膠限度試驗法(通則1143) | | 外源性 DNA殘留 | ≤100 pg/mg | 熒光定量PCR法 | | 宿主蛋白殘留 | ≤50 ppm | 中國藥典2020版第四部菌體蛋白殘留量測定法(通則3412) | | 支原體檢測 | 陰性 | 支原體檢測試劑盒 | | 重金屬殘留 | ≤10ppm | 中國藥典2020版第四部重金屬檢查法(通則0821) |
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遵循以下規(guī)范生產
1. ISO 9001:2015, certified facility。
2. 《GMP 附錄-細胞治療產品》國家藥品監(jiān)督管理局。
3. 《人用基因治療總論-中國藥典 2020》國家藥典委。
4. USP Chapter <1043>, Ancillary Materials for Cell, Gene, and Tissue-Engineered Products 用于細胞治療，基因治療和組織工程產品中的輔料。
5. USP Chapter <92>, Growth Factors and Cytokines Used in Cell Therapy Manufacturing 細胞治療產品生產過程中細胞因子和生長因子。
6. Ph. Eur. General Chapter 5.2.12, Raw Materials of Biological Origin for the Production of Cell-based and Gene Therapy Medicinal Products 用于生產細胞或基因治療藥物的生物來源原料。
產品用途
體內或體外翻譯前 mRNA 的加帽和 mRNA 的 5’末端標記。?
應用實例
完整mRNA在細胞內表達GFP蛋白，加帽酶與帽類似物對比
注意事項
1. 用于加帽反應的 RNA 在使用之前應進行純化并溶解于無核酸酶水。溶液中不能含有 EDTA 和鹽。
2. 在配置反應體系時，可以加入 0.5 μl 的 RNase 抑制劑（GMP-E125，Novoprotein），同時去掉等體積的 RNase-free Water。?
3. 在與加帽酶反應之前加熱 RNA 可以消除轉錄產物 5′的二級結構。如果轉錄產物的 5′端結構復雜，可以把加熱時間延長至10 分鐘。
4. SAM 在 pH 7–8, 37°C 條件下不穩(wěn)定，需要在反應開始之前新鮮配置。可以事先計算好 SAM 的用量，在反應開始前把分裝的 32 mM 的儲備液稀釋成 2 mM 的工作液。為避免 SAM 降解，該工作液需要保存于冰上。
5. 如果已知轉錄產物的 5′端結構復雜，反應時間可延長至 60 分鐘以提高加帽效率。
6. 在標記 5′端時，GTP 儲備液應稀釋到 mRNA 濃度的 1–3 倍。
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關鍵字： 牛痘病毒加帽酶;Vaccinia Capping Enzyme
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