線粒體提取試劑盒

一、產(chǎn)品簡介。

線粒體是細(xì)胞內(nèi)的雙層膜系結(jié)構(gòu)，含有少量 DNA 和大量能量代謝相關(guān)酶類，是細(xì)胞內(nèi)的動力工廠，參與細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)效應(yīng)。

本產(chǎn)品能夠快速且完整的提取細(xì)胞內(nèi)的線粒體，保持線粒體膜的完整性和線粒體內(nèi)各種蛋白酶類的活性，用于后續(xù)的線粒體膜電位測定、酶活性檢測，蛋白表達(dá)水平檢測和亞細(xì)胞定位分析，也可用于線粒體 DNA 的提取等實驗。

二、運輸與存儲條件。

本產(chǎn)品常溫運輸，4 ℃保存，有效期 12 個月。

三、特點與優(yōu)勢。

1. 本產(chǎn)品與 Thermo 公司的產(chǎn)品（89874）品質(zhì)類似，可以快速分離提取線粒體。

2. 本產(chǎn)品提取的線粒體完整性好，產(chǎn)量大。

四、自備試劑與耗材。

PBS、RIPA 裂解液（不含 SDS）、2.0 ml 離心管、震蕩混勻儀（Vortex mixer）、冷凍離心機(jī)。

五、使用說明。

1. 細(xì)胞收集。胰酶消化法收集貼壁細(xì)胞，或離心法直接收集懸浮細(xì)胞，每個樣品含 2×107 細(xì)胞。

2. 低滲處理。加入 800 μl Reagent MA 試劑，震蕩（Vortex）5 sec，重懸細(xì)胞。冰上孵育 2 min。（盡量不要超過 2 min，以免影響后續(xù)實驗）

3. 細(xì)胞裂解。加入 10 μl Reagent MB，劇烈震蕩（vortex at the maximum speed）5 sec，冰上孵育 5 min，每分鐘劇烈震蕩 1 次 （vortex，5 sec）。

4. 終止裂解。加入 800 μl Reagent MC，顛倒混勻幾次，此步驟不要震蕩混勻（No Vortex）。

5. 離心。700×g，4 ℃離心 10 min，棄沉淀（粗細(xì)胞核），上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中。。

6. 3,000×g，4 ℃離心 15 min，上清為細(xì)胞漿，沉淀為線粒體。細(xì)胞漿轉(zhuǎn)移到新的離心管，可凍存。（若需提高線粒體產(chǎn)量，離心條件改為 12,000×g，4 ℃離心 30 min，可以加線粒體產(chǎn)量，但也會增加溶酶體和過氧化物酶體污染）

7. 洗滌線粒體。線粒體沉淀中加入 500 μl Reagent MC，輕輕震蕩混勻，12,000×g，4 ℃離心 5 min，棄上清，沉淀即為純化的線粒體。

8. 純化的線粒體可立即用于測定膜電位，也可凍存在-80 ℃冰箱中。

9. 線粒體裂解。包括以下三種方式。

1) 變性裂解液裂解。利用本公司的細(xì)胞裂解液（Laemmli Buffer，2×，Cat：Omp-01）重懸線粒體沉淀，裂解線粒體，提取線粒體蛋白，用于后續(xù)的 western blot 分析。但提取蛋白已經(jīng)變性，不可用于酶活性測定。

2) RIPA 裂解液裂解。利用溫和的 RIPA 裂解液（不含 SDS）重懸線粒體沉淀，裂解線粒體，提取蛋白可以用于酶活性測定及 western blot 等實驗。

3) 反復(fù)凍融法裂解。用 PBS 重懸線粒體，在-80 ℃冰箱或液氮中急速凍結(jié)線粒體溶液，37℃水浴鍋中快速融化線粒體溶液，重復(fù) 3 次，完成線粒體裂解，提取蛋白可用于線粒體酶活性檢測、western blot 等實驗。

六、注意事項

1. 請用新提取的線粒體來測定膜電位，凍存后的線粒體，其膜的完整性受到破壞，不宜用于測定膜電位。

2. 整個實驗需在低溫條件下進(jìn)行，所用試劑提前預(yù)冷。

3. 分離的細(xì)胞漿可以12,000×g，4 ℃離心15 min，棄沉淀，上清轉(zhuǎn)移至新的離心管，即為純化后的細(xì)胞漿。細(xì)胞漿純化后可以減少溶酶體和過氧化物酶體的污染。

4. 細(xì)胞漿溶液中含有EGTA，不宜用BCA法測定蛋白濃度，請用Bradford法測定蛋白濃度。

5. 為了抑制蛋白降解，實驗過程中可添加蛋白酶抑制劑（如cocktail等）。