背景^[1-3]

人組織因子途徑抑制物(TFPI)Elisa試劑盒采用雙抗體夾心兩步法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。在預(yù)包被抗人組織因子途徑抑制物(TFPI)抗體（固相抗體）的微孔酶標(biāo)板中，加入人組織因子途徑抑制物(TFPI)校準(zhǔn)品和待測(cè)樣本，再加入生物素標(biāo)記抗體，經(jīng)過(guò)溫育與充分洗滌后，再加入HRP偶聯(lián)的親和素，經(jīng)過(guò)溫育與充分洗滌，去除未結(jié)合的組分，在微孔板固相表面形成固相抗體-抗原-生物素標(biāo)記抗體-親和素酶的夾心復(fù)合物。加顯色液TMB，產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物，在終止液作用下，最終轉(zhuǎn)化為黃色，在酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)上測(cè)定吸光度（OD值），吸光度（OD值）與待測(cè)樣品中人組織因子途徑抑制物(TFPI)的濃度正相關(guān)。擬合校準(zhǔn)品曲線，可以計(jì)算出樣本中人組織因子途徑抑制物(TFPI)的濃度。

人組織因子途徑抑制物(TFPI)Elisa試劑盒

人組織因子途徑抑制物(TFPI)ELISA試劑盒樣品的準(zhǔn)備和保存：

細(xì)胞培養(yǎng)上清—離心去除沉淀，立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。

血清—用干凈試管收集血液，室溫凝固30分鐘，離心2000×g 20分鐘，收集血清。立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。

血漿—采用肝素、檸檬酸鹽或EDTA抗凝，抽血后30分鐘內(nèi)在2-8℃離心2000×g 20分鐘。為消除血小板的影響，建議在2-8℃進(jìn)一步離心10000×g 10分鐘。立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。

細(xì)胞裂解液—對(duì)于貼壁細(xì)胞，去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液洗一遍。加入適量裂解液，用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。通常10秒后，細(xì)胞就會(huì)被裂解。對(duì)于懸浮細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，用PBS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液洗一遍。加入適量裂解液，用槍吹打把細(xì)胞吹散，用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞。充分裂解后，10000—14000×g離心3-5分鐘，取上清。立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。

尿液—用無(wú)菌管收集，離心2000×g 20分鐘。仔細(xì)收集上清。如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

人組織因子途徑抑制物(TFPI)ELISA試劑盒操作程序：

1、所有試劑和組分都先恢復(fù)到室溫，標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣品，建議做復(fù)孔。

2、按前面說(shuō)明書描述的方法，配制好試劑盒各種組分的工作液。

從鋁箔袋中取出所需板條，剩余的板條用自封袋密封放回冰箱。

3、設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣本稀釋液孔、空白孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL，樣本稀釋液孔加樣本稀釋液50μL，空白孔不加，樣本孔加待測(cè)樣本50μL。除空白孔外，每孔加入生物素抗體100uL，用封板膜蓋住反應(yīng)板，37℃水浴鍋或恒溫箱避光溫育60min。

4、揭開(kāi)封板膜，棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)5次。若使用自動(dòng)洗板機(jī)，請(qǐng)按洗板機(jī)操作程序進(jìn)行洗板，添加浸泡30s的程序，可以提高檢測(cè)的精度。洗板結(jié)束，加底物前，要在干凈不掉屑的紙上，充分拍干反應(yīng)板。

5、除空白孔外，每孔加入HRP標(biāo)記親和素100uL，用封板膜蓋住反應(yīng)板，37℃水浴鍋或恒溫箱避光溫育20min。

6、重復(fù)步驟4。

7、所有孔中加入底物顯色液100μL。用封板膜蓋住反應(yīng)板，37℃水浴鍋或恒溫箱避光溫育15min。

8、所有孔加入終止液50μL，在450nm波長(zhǎng)酶標(biāo)儀上讀取各孔吸光度（OD值）。

應(yīng)用^[4][5]

人組織因子途徑抑制物(TFPI)Elisa試劑盒可以用于組織因子基因沉默對(duì)胎盤早剝HUVECs的影響

在原代培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的基礎(chǔ)上，建立組織因子基因干擾載體系統(tǒng)，利用近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的RNAi技術(shù)，分別對(duì)胎盤早剝和正常出生的新生兒臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的組織因子表達(dá)進(jìn)行干預(yù)，將構(gòu)建的組織因子干擾載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，沉默內(nèi)皮細(xì)胞組織因子表達(dá)，為進(jìn)一步的基因治療打下基礎(chǔ)。

方法1、按照試劑盒說(shuō)明書，采用人組織因子途徑抑制物(TFPI)Elisa試劑盒以正常分娩作為對(duì)照，測(cè)定胎盤早剝產(chǎn)婦血、臍血及所生新生兒血TF、TFPI，并計(jì)算出TFPI／TF的值。2、HUVECs的體外培養(yǎng)和鑒定：無(wú)菌剪取剛分娩的臍帶約10cm，擠去臍帶血管中的血液，PBS反復(fù)沖洗掉臍帶外及末端血跡，再用PBS 20～40ml持續(xù)沖洗臍靜脈腔，至流出的液體無(wú)色或淡洗肉水色，0.1％膠原酶Ⅱ5～10ml，灌入臍靜脈，37℃孵育消化12min，收集消化液再用PBS約20ml反復(fù)沖洗臍靜脈，加入胎牛血清終止消化，將收集液1000r／min×10min，常溫離心，棄上清，在收集細(xì)胞沉淀中加入完全培養(yǎng)基，反復(fù)吹打使細(xì)胞團(tuán)成為單個(gè)細(xì)胞，接種至25cm2培養(yǎng)瓶中，37℃，5％CO2，培養(yǎng)24h后觀察，見(jiàn)較多細(xì)胞貼壁伸展生長(zhǎng)，成梭形或三角形，換液，再加入含有表皮生長(zhǎng)因子（Edothenial grouth factor，EGF）培養(yǎng)48～72小時(shí)至細(xì)胞基本長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法進(jìn)行Ⅷ因子相關(guān)抗原鑒定，取第2、3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

參考文獻(xiàn)

[1]Comparison of Gene Silencing in Human Vascular Cells Using Small Interfering RNAs[J].Nicholas D.Andersen;;Thomas S.Monahan;;Junaid Y.Malek;;Monica Jain;;Soizic Daniel;;Lena D.Caron;;Leena Pradhan;;Christiane Ferran;;Frank W.LoGerfo.Journal of the American College of Surgeons,2007(3)

[2]Intertwining of thrombosis and inflammation in atherosclerosis[J].Kevin Croce;;Peter Libby.Current Opinion in Hematology,2007(1)

[3]Indole-3-carbinol alters placental cytochrome P450 1A1 and P-glycoprotein levels in rats:A potential role in intensifying fetal intrauterine growth-retardation produced by tobacco smoke[J].You-E Yan;;Hui Wang;;Ting Wang;;Han-Gao Zeng.Experimental and Toxicologic Pathology,2006(1)

[4]Maternal-fetal conditions necessitating a medical intervention resulting in preterm birth[J].Cande V.Ananth;;Anthony M.Vintzileos.American Journal of Obstetrics and Gynecology,2006(6)

[5]唐雯.組織因子基因沉默對(duì)胎盤早剝HUVECs的影響[D].南方醫(yī)科大學(xué),2007.